免疫沉淀与免疫共沉淀原理及方法

免疫沉淀与免疫共沉淀原理及方法一、基本概念免疫沉淀（immunoprecipitation）是利用抗体可与抗原特异性结合的特性，将抗原（常为靶蛋白）从混合体系沉淀下来，初步分离靶蛋白的一种方法。免疫共沉淀（coimmunoprecipitation）是一种在体外探测两个蛋白分子间是否存在特异性相互作用的一种方法。其原理是如果两个蛋白在体外体系能够发生特异性相互作用的话，那么当用一种蛋白的抗体进行免疫沉淀时，另一个蛋白也会被同时沉淀下来。与酵母双杂交技术不同，免疫共沉淀技术所利用的是抗原和抗体间的免疫反应，是一种基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用的方法。不难看出，免疫共沉淀与免疫沉淀技术所使用的原理与方法大致相似，所不同的是，在免疫共沉淀中，对靶蛋白的结合与沉淀由另一个与之发生相互作用的蛋白替代。在免疫共沉淀或免疫沉淀的基础上，通过进一步与其它技术的结合，如聚丙烯酰胺凝胶电泳，还可进一步对靶蛋白的的分子量等特性进行鉴定。二、抗体的选择（一）多克隆抗体多克隆抗体因其制备相对简单，可与靶蛋白分子的多个位点结合，所形成的抗原抗体复合物较稳定因而应用的最为广泛。但多克隆抗体的缺点在于非特异性结合较多，常会导致反映本底（是否是背景）升高和一定的假阳性结果。（二）单克隆抗体与多克隆抗体相比，单克隆抗体往往只结合一种抗原表位，具有单一结合特异性，所以发生非特异结合的机会少，可被用于确定靶蛋白上某一部位的特殊结构，甚至可被用于区分相同靶蛋白的不同形式如构象变化和修饰。但反过来，单克隆抗体仅与单一表位结合的特性也会引起具有同一表位的不同靶蛋白间的交叉反应。三、免疫沉淀方法免疫沉淀的靶蛋白一般来自细胞裂解液，可以是被同位素标记的也可以是未被标记的。若为前者，免疫沉淀后再经聚丙烯酰胺凝胶电泳，只需压片即可检测到靶蛋白的存在；若为后者，经免疫沉淀和聚丙烯酰凝胶电泳后，尚需借助银染或免疫印迹进行鉴定。（一）所需试剂及溶液改良的RIPA液（细胞裂解液）、稀释缓冲液（常用PBS溶液）、TSA溶液、0.05mol/lTris（pH6.8）、2×SDS蛋白上样缓冲液、抗体与Sepharose或抗免疫球蛋白抗体、蛋白A、蛋白G的交联物。改良的RIPA液的组成（100ml体系）：Tris-HCl:50mM（pH7.4）、NP-40:1%脱氧胆酸钠（0.25%）、NaCl（150mM）、EDTA（1mM）、PMSF（1mM）、抑肽酶、亮肽酶素、抑肽素（各1µg/ml）、Na3VO4（1mM）、NaF（1mM）。（二）方法1．用冰冷的PBS溶液洗涤贴壁细胞两次，弃干净PBS。（对于悬浮细胞则用台式离心机以800-1000rpm转速通过离心洗涤）。2．给细胞培养瓶中加入冰冷的改良RIPA液，RIPA液的用量：按照1ml/107细胞/100mm培养面/150cm2瓶或0.5ml每5×106细胞/60mm培养面/75cm2瓶计算。3．用经蒸馏水预冷的橡皮或塑料细胞刮棒将贴壁细胞转移至一离心管中，轻轻混匀细胞悬液，用振荡器在4℃振荡15min以裂解细胞。4．于4℃，14000g离心裂解液15min，迅速转移上清至另一离心管中，弃掉沉淀。5．准备蛋白A（蛋白G或Sepharose）：用PBS洗涤蛋白A（蛋白G或Sepharose）珠子两次，并将其用PBS调制成50％悬液。6．每1ml细胞裂解液上清加入100µl蛋白A，4℃，振荡10min，进行预清除。7．4℃，14000g离心10min移去蛋白A（蛋白G或Sepharose）珠子，转移上清至一新离心管中。8．用Bradford法（考马斯亮蓝染色法）测定蛋白浓度。（应至少将细胞裂解液作1：10稀释后再测定，这是因为存在于裂解液中的去污剂成分会干扰考马斯亮蓝的作用）。9．根据所测得的细胞裂解液蛋白浓度，用PBS将其稀释至1mg/ml以降低缓冲体系中去污剂的浓度（但对于那些在细胞中表达水平较低的蛋白而言，10mg/ml这样更高的浓度可能对免疫沉淀更有效一些）。10．加入推荐体积的免疫沉淀抗体至500µl细胞裂解液中。（抗体的最适用量要根据每一细胞模型中免疫沉淀靶蛋白的数量来确定）。11．将细胞裂解液与抗体轻轻混匀后孵育2h，或置摇床上振荡4℃过夜。（选择孵育2h常用于免疫沉淀与激酶或磷酸酯酶作用的活化酶。）加入100µl蛋白A（蛋白G或Sepharose）轻轻振荡1h或4℃过夜以捕获免疫沉淀复合物。（在多数情况下，加入2µg像兔抗小鼠IgG这样的桥连抗体可以增强对免疫复合物的捕获能力，这对于像小鼠IgG1或由鸡所产生的低亲和力抗体尤为重要）。12．通过脉冲离心（14000rpm，5s）收集琼脂糖/Sepharose珠子，弃掉上清，用800µl冰冷的改良RIPA缓冲液洗涤珠子3次。13．将琼脂糖/Sepharose珠子重悬于60µl2×SDS蛋白上样缓冲液中，轻混均匀后煮沸5min，200g离心1min弃掉珠子。14．将上清转移至一新离心管中-20℃冻存或进行SDS-PAGE电泳。