微生物的代谢调控理论

第三章微生物的代谢调控理论及其在食品发酵与酿造中的应用王青云E-mail：[e-mail]第一节微生物的代谢与调节的生化基础节调谢代★是生物在长期进化过程中，为适应外界条件而形成的一种复杂的生理机能。通过调节作用细胞内的各种物质及能量代谢得到协调和统一，使生物体能更好地利用环境条件来完成复杂的生命活动。•一、初级代谢和次级代谢•合成代谢和分解代谢（P49）•初级代谢和次级代谢（P49～P50）•（1）调节营养物质透过细胞膜而进入细胞的能力---通道调节；•（2）调节代谢流---通量调节；•（3）通过酶的定位以限制它与相应底物的接近---限制其基质有形接近。代谢流调节粗调：酶量的调节。微调：现有的酶的活性的调节。二、代谢调控的方式三、与代谢调节有关的酶（一）同功酶调节•同功酶：指能催化相同的生化反应，但酶蛋白分子结构有差异的一类酶，它们虽同存于一个个体或同一组织中，但在生理、免疫和理化特性上却存在着差别。•同功酶在代谢调节中的作用：在一个分支代谢途径中，如果在分支点以前的一个较早的反应是由几个同功酶所催化时，则分支代谢的几个最终产物往往分别对这几个同功酶发生抑制作用。同工酶调节示意图•（二）别构酶：具有别构作用（或变构作用）的酶。其分子有活性中心和别构中心，往往是具有四级结构的多亚基的寡聚酶。多数别构酶处于代谢途径的开端，别构剂多是一些生理性小分子及该酶作用的底物或该代谢途径的中间产物或终产物。故别构酶的催化活性受细胞内底物浓度、代谢中间物或终产物浓度的调节。终产物抑制该途径中的别构酶称反馈抑制(feedbackinhibition)。别构酶在细胞物质代谢上的调节中发挥重要作用，故又称调节酶。（regulatoryenzyme）（中国酶网）•（三）多功能酶：分子组成只有一条多肽链，但具有两种或两种以上催化活力的酶。•一个终产物的过量，在使共同途径第一步反应受到部分抑制的同时，分支途径第一步反应也受到抑制，使代谢沿着其他分支进行。因此，一个产物的过量不致干扰其他产物的生成。第二节微生物代谢的协调作用一、酶活性的调节酶活性的调节：是指在酶分子水平上的一种代谢调节，它是通过改变现成的酶分子活性来调节新陈代谢的速率，包括酶活性的激活和抑制两个方面。（1）酶活性的激活：指在分解代谢途径中，后面的反应可被较前面的中间产物所促进。（2）酶活性的抑制：主要是反馈抑制。反馈抑制：某代谢途径的末端产物（即终产物）过量时，这个产物可反过来直接抑制该途径中第一个酶的活性，促使整个反应过程减慢或停止，从而避免了末端产物的过多累积。（3）反馈抑制的类型•①直线式代谢途径中的反馈抑制•②分支代谢途径中的反馈抑制。•在分支代谢途径中，反馈抑制的情况较为复杂。•为避免在一个分支上的产物过多时不致同时影响另一分支上产物的供应，微生物已发展出多种调节方式。•（1）协同反馈抑制：指分支代谢途径中的几个末端产物同时过量时才能抑制共同途径中的第一个酶的一种反馈调节方式。•（2）合作反馈抑制：指两种末端产物同时存在时，可以起着比一种末端产物大得多的反馈抑制作用。•（3）累积反馈抑制：每一分支途径的末端产物按一定百分率单独抑制共同途径中前面的酶，所以当几种末端产物共同存在时，它们的抑制作用是累积的。•（4）顺序反馈抑制：•当E过多时，可抑制C→D，这时由于C的浓度过大而促使反应向F、G方向进行，结果又造成了另一末端产物G浓度的增高。由于G过多就抑制了C→F，结果造成C的浓度进一步增高。C过多又对A→B间的酶发生抑制，从而达到了反馈抑制的效果。这种通过逐步有顺序的方式达到的调节，称为顺序反馈抑制。二、酶合成的调节•酶合成的调节是一种通过调节酶的合成量进而调节代谢速率的调节机制，这是一种在基因水平上（在原核生物中主要在转录水平上）的代谢调节。•凡能促进酶生物合成的现象，称为诱导。•能阻碍酶生物合成的现象，则称为阻遏。•与调节酶活性的反馈抑制等相比，调节酶的合成（即产酶量）而实现代谢调节的方式是一类较间接而缓慢的调节方式。•其优点则是通过阻止酶的过量合成，有利于节约生物合成的原料和能量。•在正常代谢途径中，酶活性调节和酶合成调节两者是同时存在且密切配合、协调进行的。酶合成调节与酶活性调节的比较（一）酶合成调节的类型•1．诱导•根据酶的生成是否与环境中所存在的该酶底物或其有关物的关系，可把酶划分成组成酶和诱导酶两类。•诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶。•能促进诱导酶产生的物质称为诱导物，它可以是该酶的底物，也可以是难以代谢的底物类似物或是底物的前体物质。•同时诱导，即当诱导物加入后，微生物能同时或几乎同时诱导几种酶的合成，它主要存在于短的代谢途径中。例如，将乳糖加入到E．coli培养基中后，即可同时诱导出β-半乳糖苷透性酶、β-半乳糖苷酶和半乳糖苷转乙酰酶的合成；•顺序诱导，即先合成能分解底物的酶，再依次合成分解各中间代谢物的酶，以达到对较复杂代谢途径的分段调节。2．阻遏•在微生物的代谢过程中，当代谢途径中某末端产物过量时，除可用前述的反馈抑制的方式来抑制该途径中关键酶的活性以减少末端产物的生成外，还可通过阻遏作用来阻碍代谢途径中包括关键酶在内的一系列酶的生物合成，从而更彻底地控制代谢和减少末端产物的合成。•阻遏作用有利于生物体节省有限的养料和能量。•阻遏的类型主要有末端代谢产物阻遏和分解代谢产物阻遏两种。•（1）末端产物阻遏•指由某代谢途径末端产物的过量累积而引起的阻遏。对直线式反应途径来说，末端产物阻遏的情况较为简单，即产物作用于代谢途径中的各种酶，使之合成受阻遏。•对分支代谢途径来说，情况就较复杂。每种末端产物仅专一地阻遏合成它的那条分支途径的酶。•代谢途径分支点以前的“公共酶”仅受所有分支途径末端产物的阻遏，此即称多价阻遏作用。•末端产物阻遏在代谢调节中有着重要的作用，它可保证细胞内各种物质维持适当的浓度。（2）分解代谢物阻遏•概念：指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。•分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。•因此，分解代谢物的阻遏作用，就是指代谢反应链中，某些中间代谢物或末端代谢物的过量累积而阻遏代谢途径中一些酶合成的现象。•分解代谢物阻遏的典型实例：葡萄糖效应•葡萄糖效应（glucoseeffect）：又称葡萄糖阻遏或分解代谢产生阻遏作用。葡萄糖或某些容易利用的碳源,其分解代谢产物阻遏某些诱导酶体系编码的基因转录的现象。（二）酶合成调节的机制1.操纵子：是在转录水平上控制基因表达的协调单位，由调节基因（R）、启动子（P）、操纵基因（O）和在功能上相关的几个结构基因(S)组成；•调节基因:用于编码调节蛋白的基因。•启动基因:是一种能被依赖于DNA的RNA聚合酶所识别的碱基顺序，它既是RNA多聚酶的结合部位，也是转录的起始点；•操纵基因是位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能与阻遏物（一种调节蛋白）相结合，以此来决定结构基因的转录是否能进行；•结构基因则是决定某一多肽的DNA模板，可根据其上的碱基顺序转录出对应的mRNA，然后再可通过核糖体而转译出相应的酶。一个操纵子的转录，就合成了一个mRNA分子。•操纵子分两类:•一类是诱导型操纵子，只有当存在诱导物（一种效应物）时，其转录频率才最高，并随之转译出大量诱导酶，出现诱导现象。•另一类是阻遏型操纵子，只有当缺乏辅阻遏物（一种效应物）时，其转录频率才最高。由阻遏型操纵子所编码的酶的合成，只有通过去阻遏作用才能启动。•效应物•是一类低分子量的信号物质（如糖类及其衍生物、氨基酸和核苷酸等），包括诱导物和辅阻遏物两种，它们可与调节蛋白相结合以使后者发生变构作用，并进一步提高或降低与操纵基因的结合能力。•调节蛋白•是一类变构蛋白，它有两个特殊位点，其一可与操纵基因结合，另一位点则可与效应物相结合。当调节蛋白与效应物结合后，就发生变构作用。有的调节蛋白在其变构后可提高与操纵基因的结合能力，有的则会降低其结合能力。•调节蛋白可分两种，其一称阻遏物，它能在没有诱导物（效应物的一种）时与操纵基因相结合；另一则称阻遏物蛋白，它只能在辅阻遏物（效应物的另一种）存在时才能与操纵基因相结合。大肠杆菌乳糖酶诱导合成---调节基因产物对转录的调控调节基因操纵基因结构基因阻遏蛋白操纵基因——基因合成的开关.关——阻遏蛋白阻挡操纵基因，结构基因不表达.开——诱导物阻止阻遏蛋白功能发挥.诱导物（乳糖）mRNA三、能荷的调节1.能荷（energycharge）能荷是一个表示细胞能量状态的参数。是细胞中所含有的相当于ATP的数量的腺苷酸分子数占全部腺苷酸分子数的百分比，其表示式为：能荷（EC））=[ATP]+0.5[ADP][ATP]+[ADP]+[AMP]×100%当细胞中腺苷酸全部是ATP，能荷为1；当细胞中腺苷酸全部是ADP，能荷为0.5；当细胞中腺苷酸全部是AMP，能荷为0当细胞或线粒体中三种核苷酸同时并存时，能荷大小随三者比例而异，三者的比例随细胞生理状态而变化。•2.能荷在细胞不同生长时期的变化•E.coli生长期间，能荷为0.8，静止期为0.5，低于0.5时死亡；•Asp.niger柠檬酸生产菌，生长期能荷为0.85，而产酸期为0.8。•另外一个度量细胞能量状态的参数是磷酸化位。磷酸化位=[ATP]/[ADP][Pi]•磷酸化位除了腺苷酸外，还决定于无机磷浓度。•磷酸化位与能荷相比，其值变化范围更宽，因此是反映细胞能量状态更加灵敏的指标。•3.能荷调节的意义当能荷降低时：则激活催化糖分解，（能量生成）酶系，或解除ATP对这些酶的抑制（如糖原磷酸化酶、果糖磷酸激酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶、反丁烯二酸酶等）并抑制糖原合成酶，1、6磷酸果糖酯酶，从而加速糖分解和TCA的产能代谢。当能荷升高时：细胞中AMP，ADP转变为ATP，这时ATP则抑制糖原降解以及糖酵解和TCA环中的关键酶（如糖原磷酸化酶，磷酸果糖激酶，柠檬酸合成酶，异柠檬酸脱氢酶）并激活糖类合成酶（糖原合成酶、1、6-P-果糖酯酶）从而抑制糖的分解，加速糖原的合成。4.能荷调节与巴斯德效应：巴斯德效应（Pasteureffect)：巴斯德在研究酵母的酒精发酵时发现：在通氧的情况下，由于进行呼吸作用，酒精产量大大下降，糖的消耗速度也变缓，这种有氧呼吸抑制发酵的作用被后人称为巴斯德效应。巴斯德效应是能荷调节的一个好的实例。第三节代谢调控在工业发酵中的应用一、发酵工艺条件的控制环境条件既影响微生物生长，又影响代谢速度和方向及产物形成与积累。现以谷氨酸棒杆菌发酵为例来说明控制发酵条件包括O2浓度、NH4浓度、pH、磷酸盐浓度、生物素浓度等，环境条件改变，可使代谢转换方向，不生成谷氨酸，而生成乳酸、琥珀酸、谷氨酰胺等产物。二、菌种遗传特性的改变•（一）应用营养缺陷型菌株以解除正常的反馈调节•营养缺陷型菌株：野生型菌株经过人工诱变或者自然突变失去合成某种营养（氨基酸，维生素，核酸等）的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长的菌株。•营养缺陷型是一种生化突变株，它的出现是由基因突变引起的。由于核酸系列中某碱基发生突变，导致该基因所控制的酶合成受阻，该菌株也因此不能合成某种营养因子，从而使正常代谢失去平衡。一、代谢缺陷型菌株（营养缺陷突变株）1、无分支途径ABCDE无分支途径（即直线型合成途径），通常因终产物E对途径第一个酶的反馈抑制或阻遏而受调节控制，若我们选育失去CD的能力的D或E的营养缺陷型突变株，在培养基中添加D或E使之足以维持生长，但不足引起反馈抑制与阻遏，则解除了E对此途径的反馈调节，那么就会使中间产物C得以大量积累。这类菌株不能积累末端产物，只能积累中间产物。例如谷氨酸棒杆菌的瓜氨酸缺陷突变株可积累鸟氨酸。谷氨酸棒杆菌鸟氨酸生物合成途径①乙酰谷氨酸合成酶②乙酰谷氨酸激酶③NO乙酰谷