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课件说明本课件是为本院的细胞生物学教学制作的，适用于生物科学、生物技术专业的本科生实验教学。本课件结合实验条件与学生的实际情况，内容包括一些常用的细胞生物学基本实验，如特殊显微镜的使用、显微摄影技术、细胞化学技术、细胞组分的分级分离、细胞染色体技术、细胞培养、细胞融合、细胞生理活动等。课件除对实验原理、过程作简明的文字阐述外，还包含相当的图表，使学生直观地了解并掌握有关的实验技术原理和操作方法。本课件的使用有助于培养学生动手实践、观察分析和解决问题的能力。细胞生物学实验常用实验动物的了解和解剖器械的使用一、常用实验动物细胞生物学实验中，除应用培养细胞外，最常用的动物是蟾蜍和小白鼠，下面对其特点及基本处置做一简单的介绍。蟾蜍蟾蜍是两栖类动物，由于其取材方便，常用于各种实验。其细胞较哺乳类动物的细胞大得多，因此常用于观察细胞形态的实验。1．雌雄鉴别通常雄性蟾蜍较雌性的为小，且在其前肢的l～3趾基部有被称为婚垫的黑疣。2．捉拿及处死方法：常用捣髓法处死蟾蜍，即用解剖针捣毁其脑组织和脊髓。具体方法是，左手握住蟾蜍的身体和四肢，使其腹部贴着掌心，食指压住蟾蜍头部前端使其尽量腹屈。在头与躯干之间可触及一凹陷(即枕骨大孔所在处)，右手持解剖针直插入此凹陷约l～2mm，随即将针尖转向头侧插入颅腔捣毁脑组织。然后将解剖针抽回并转向尾侧刺入脊椎管内捣毁其脊髓。如此直至其四肢松软，呼吸消失为止。小白鼠小白鼠是哺乳动物，是最为常用的实验动物。1．捉拿方法：将小白鼠放在鼠笼盖铁网上，用右手持其尾巴向后拉，小鼠则会尽力向前蹬。用左手的拇指和食指抓住其头顶部皮肤，然后用左手小指与手掌之间夹住其尾巴。2．处死方法：处死应以安乐死为原则，即使之无痛苦而迅速死亡。常用的方法有颈椎脱位法，断头法和二氧化碳吸入法等。断头法需用特殊的断头器，二氧化碳吸入法则将小鼠放入盛有二氧化碳的容器内即可。颈椎脱位法的具体方法是：左手拇指和食指按住小白鼠的头部，左手捉住其尾巴迅速向后猛拉，使其颈椎脱位而立即死亡。小鼠的脱臼处死法3．给药方法：小自鼠的给药途径有经口给药、腹腔内注射、尾静脉注射、皮下注射、皮内注射和肌肉注射等。我们常用的是腹腔注射。具体方法是：左手捉住小鼠(如前所述)，在其腹正中线稍外侧(避开膀胱和血管)用酒精消毒后，首先将注射针头向头部方向刺入皮下，进针1～2mm后，再以45°角刺穿腹部肌肉而进入腹腔(刺穿腹肌时有一落空感)。针头刺入腹腔后切勿左右摆动，以免损伤肠管或肝脏。注意每次注入的液体量应为0.1～0.2ml／10克体重。二、常用手术器械及操作方法：1．解剖针：用于挑、刺等。常用来捣髓处死蟾蜍，持法如执笔法。2．解剖刀(即外科手术刀)：用于各种皮肤切口和组织切除等。持法有执弓法与执笔法两种。前者用于较大力量切开较长距离的坚韧的组织，如大动物的皮肤切口等；后者则用于小力量的短距离切开，或分离皮肤和肌肉等。3．大剪刀：用于剪毛、皮肤、皮下组织和肌肉等。4．眼科剪刀：用于剪断神经、血管、筋膜等细软组织。5．眼科镊子：用于提取神经、血管和筋膜等细软组织。6．钝头镊子：用于提取脏器、组织等。7．有钩镊子：用于提取皮肤切口等。细胞生物学实验绘图方法与要求(一)生物绘图的要求•具有高度的科学性，不得有科学性错误。形态结构要准确，比例要正确，要求真实感，立体感，精美而美观。•图面要力求整洁，铅笔要保持尖锐，尽量少用橡皮。•绘图大小要适宜，位置略偏左，右边留着注图。•绘图的线条要光滑、匀称，点点要大小一致。•绘图要完善，字体用正楷，大小要均匀，不能潦草。注图线用直尺画出，间隔要均匀，且一般多向右边引出，图注部分接近时可用折线，但注图线之间不能交叉，图注要尽量排列整齐。•绘图完成后在绘图纸上方要写明实验名称、班级、姓名、时间，在图的下方注明图名及放大倍数。(二)生物绘图的方法点点衬阴法:将图形画出后，用铅笔点出圆点，以表示明暗和深浅，给予立体感。在暗处点要密，明处要疏，但要求点要均匀，点点要从明处点起，一行行交互着点，物体上的斑纹描出再点点衬阴，点点衬阴法要求不能用涂抹阴影的方法以代替点点，此点初学者要尤为注意。轮廓图（左）和细胞图（右）实验一普通光学显微镜的结构及其使用[目的要求]1、掌握普通光学显微镜的主要构造及其性能;2、掌握低、高倍镜的正规使用方法，反复练习，观察时保持两眼同时睁开和两手并用。[实验用品]光学显微镜、各种动植物玻片标本。[实验内容和方法]一、光学显微镜的主要构造主要分为三部分：机械部分、照明部分和光学部分(一)机械部分1.镜座2.镜柱3.镜臂4.镜筒5.调节器6.物镜转换器(旋转盘)7.载物台(二)照明部分1．集光器:(1)集光镜(2)虹彩光圈2．反光镜(三)光学部分1．目镜常备有2—3个目镜，上面刻有5x、10x、15×等符号以示其放大倍数，可选择使用，一般常用的目镜倍数为10x。2．物镜主要性能指标——放大倍数和镜口率(如10／0.25、40／0.65和100／1.25)，镜筒长度和所要求的盖玻片厚度(如160／0.17)。二、显微镜的使用方法显微镜在使用前，应先检查一下它的各个部件是否完整和正常，并进行必要的清洁工作，然后将显微镜放置在自己左肩前方的实验台上，离桌子边缘3—6cm为宜，以便观察。(一)低倍镜的使用方法1．对光2．放置玻片标本3．调节焦距(二)高倍镜的使用方法1.一定要先在低倍镜下找到要观察的标本物像后，再把需要放大的部分移至视野正中，并把物像调节到最清晰的程度。2．转动物镜转换器(三)油镜的使用方法1.在高倍镜下找到所要观察的标本移至视野中心。2.把集光器上升到最高位置，光阑开到最大。3.移开高倍镜，在要观察的部位的盖玻片上滴加一滴香柏油作为介质。4．稍稍上升镜筒或下降载物台，使油镜对准通光孔，慢慢转动粗调螺旋，使油镜与油滴接触，再小心地使它贴近盖玻片表面。5．用眼观察目镜，微微上升或下降载物台，直到出现清晰的物像。6．油镜使用完毕，先用拭镜纸蘸少许二甲苯将镜头上的大部分油去掉，再用干拭镜纸擦拭。擦拭时要顺镜头的直径方向，不要沿镜头的圆周擦。四、操作练习『思考题』一、在调焦操作时，为什么低倍镜要先调到距标本片表面＜6mm处，油镜一定要贴近标本片表面？如果把标本片放反了，将会出现什么问题？为什么？二、在低倍镜调节焦距时。当视野中出现了能随标本片移动而移动的颗粒或斑纹。是否只要调节推进器将标本对准物镜中央，就一定能观察到标本的物像?为什么?三、你如何分析判断视野中所见到的污物点是在目镜上?四、使用显微镜观察标本，为什么—定要从低倍镜到高倍镜再到油镜的顺序进行?五、在转动细调螺旋时，如已达极限转不动时，你应如何解决?实验二、几种特殊光学显微镜的工作原理及其使用『目的要求』了解暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和倒置显微镜的工作原理、构造和使用方法。『实验用品』暗视野显微镜、倒置显微镜、相差显微镜、荧光显微镜（透射式和落射式）、黑纸片、剪刀、圆规、无荧光镜油、培养的活细胞、丫啶橙染色玻片标本、活细胞临时装片（盐藻）。『实验内容和方法』一、暗视野显微镜(一)原理和结构特点原理:利用光学上的丁达尔现象设计的。结构特点:中央遮光板或暗视野聚光器，从而使光线改变途径，倾斜地照射在观察的标本上，照明光线在聚光器顶透镜（或盖片）的上表面发生全反射，因而背景是暗的。标本被斜射光照射发生反射或散射，在黑暗的背景下呈现明亮的像。只能看到物体的存在和运动，不能辨清物体的细微结构。可分辨0.004um以上的微粒的存在和运动，可用以观察活细胞的结构和细胞内微粒的运动等。（三）使用方法1．装暗视野聚光器。2．选用强的光源，一般用显微镜灯照明。3．在聚光器和标本片之间要加一滴香柏油。4．升降集光器，将集光镜的焦点对准被检物体，应首先进行中心调节，使聚光器的光轴与显微镜的光轴严格位于一直线上。5．以下操作方法同普通显微镜。（四）观察二、相差显微镜(一)原理和结构特点原理：相差显微镜能够改变直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉现象，把相差变成振幅差(明暗差)，可用以观察活细胞或未染色标本。结构特点：用环状光阑代替可变光阑，用带相板的物镜(通常标有Ph的标记)代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。(二)使用方法1．相差装置的调换安装将环状光阑装在聚光器支架上，把绿色滤光片放在上面，换上相差物镜。2．调焦3．合铀调整(三)观察观察活细胞，可清楚地分辨细胞的形态，细胞核、核仁以及胞质中存在的颗粒状结构。用途：观察活细胞和未经染色的玻片标本三、荧光显微镜(一)原理和结构特点原理：利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光365nm或紫蓝光420nm)作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。按光路分两种：1．透射式荧光显微镜2．落射式荧光显微镜（二）使用方法1．打开灯源，预热几分钟。2．透射式荧光显微镜需在灯源与聚光器之间装上所要求的激发滤片，在物镜的后面装上相应的阻断滤片。落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的插块。3．用低倍镜观察，调整光源中心，使其位于整个照明光斑的中央。4．放置标本片，调焦后即可观察。(三)观察用蓝紫光滤光片，可见经0.01％的丫啶橙荧光染料染色的细胞，细胞核和细胞质被激发产生两种不同颜色的荧光(暗绿色和橙红色)。荧光显微镜照片（微管呈绿色、DNA蓝色）四、倒置显微镜光学原理与普通光学显微镜原理基本相同，主要差别是倒置显微镜的光源安装在标本的上方，物镜装在标本的下方，因此可以用来观察生长在培养皿底部的细胞状态。它与相差装置配合，可以用来观察培养的活细胞。[作业]一、比较四种特殊的光学显微镜。二、为什么说倒置相按显微镜是观察培养活细胞的最有效显微镜?三、荧光显微镜的两种滤光片各起什么作用?四、描述在特殊光镜观察到的盐藻形态。实验三、显微摄影技术『目的要求』：掌握显微摄影原理、装置及其操作技术，能独立完成全过程『实验用品』:复式光学显微镜、摄影装置、各色滤光镜、胶片、显影罐、黑白放大机、暗室袋、暗盒、定时器、标本玻片、显影及定影液『实验内容和方法』一、显微摄影装置专用摄影目镜，再装上一个无镜头相机，测光系统—可提供感光量参考值；自动控制感光装置—似“傻瓜”相机，以图像亮度自动设定感光时间，并据此开启快门曝光。二、胶片的选择高分辨力、大反差、色饱和度高而颗粒细，感光灵敏度低。胶片的照相性能：感光度；反差系数；宽容度；解像力；标准倒易率失效补偿值三、显微摄影的一般步骤（一）拍摄前准备工作1、显微镜的光路合轴：聚光器的调中，光源调中2、选用合适的物镜和目镜；3、合理调节孔径光阑的开度；4、加用滤色镜（二）装入胶片：同普通相机（三）取景和聚焦（1）屈光度调节：（2）取景：（3）聚焦：（四）曝光：显微摄影拍摄的曲细精管横切面（精细胞的不同发育阶段）『思考题』一、显微摄影为什么特别强调提高影像的反差，如何提高？二、取景聚焦时，为什么要进行屈光度调节？三、什么是倒易率失效？显微摄影时如何对待它？四、你认为要得到一张较好的显微摄影照片，应注意那些方面的问题，主要关键是什么？实验四、DNA的原位显示—Feulgen染色法『目的要求』1、掌握Feulgen反应的基本原理2、掌握Feulgen反应操作全过程。3、熟悉细胞化学技术『实验用品』光学显微镜、恒温水浴锅、染色缸、小烧杯、滴管、载玻片、Schiff试剂、1N的HCL溶液、3%的亚硫酸氢钠溶液，4.5%的醋酸、洋葱根尖『实验原理』DNA经弱酸（1N的HCL）水解，其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打开，使脱氧核糖的一端形成游离的醛基，这些醛基在原位与Schiff试剂（无色品红亚硫酸溶液）反应，形成紫红色的化合物，使细胞内含有DNA的部位呈紫红色阳性反应。紫红色的产生是因为反应产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色团，所以具有颜色。对照组预先用热三氯醋酸或DNA酶处理，抽提去细胞中的DNA而得到阴性反应，从而证明了Feulgen反应的专一性。『实验内容和方法』（一）Feulgen反应的一般步骤：