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实验一、光学显微镜构造和使用细胞生物学实验规则：•保持实验室和实验台面的整洁；•保持安静有序的实验秩序；•规范操作，爱护仪器设备；•不随意动用不必要的仪器设备，更不可在不懂操作规程的情况下或不按规范使用仪器设备；•实验结束后认真、完整地填写“仪器设备使用记录”，仪器运行出现异常或损坏要及时报告老师，不可私自拆装仪器；•鼓励提出实验设计或操作的改进意见；•独立完成实验报告。本学期细胞生物学实验开设项目和时间安排序号项目名称学时性质01显微技术总论（光学显微镜构造及使用）6综合性02叶绿体的提取分离和荧光观察3综合性03细胞器的超活染色技术3验证性04哺乳类红细胞综合实验（细胞凝集和低渗溶血）3验证性05巨噬细胞吞噬现象观察3验证性06植物染色体标本制作和组型分析6综合性07动物染色体标本制作技术3综合性08动物细胞微丝束的光学显微观察6综合性09染色体核仁组织区的银染色法3验证性10鸡红细胞融合实验3验证性11生物制片技术6综合性光学显微镜构造和使用一、实验目的1．了解和掌握普通光镜、暗视场显微镜、相差、荧光、微分干涉差、倒置等显微镜的原理和使用方法。同时简单介绍电镜原理。2．了解掌握光学显微镜的光路合轴方法，了解显微摄影的基本操作。二、原理和方法一）普通（明场）光学显微镜1．普通明场光学显微镜各零部件构成：镜座、柱、筒、臂、转换器、载物台、调节器、光源及光源聚光镜，视场光阑、孔径光阑、镜台下聚光器、聚光器前透镜、物镜和目镜。2．物镜的种类：消色差物镜、复消色差物镜、平场物镜。3．显微镜的光路原理（略）光源色光→视场光阑—折射→孔径光阑→聚光镜→样品在物镜后焦平面成像→目镜观察4．显微性能参数显微镜的性能参数包括分辨率、放大率，焦点深度、视场宽度等。1）分辨率：R=0.61λ/N.A.；N.A.＝ｎsinα/2式中：n=介质折射率；α=孔径角（镜口角，物镜最边缘斜光线与显微镜光轴所成的交角），N.A.=数值孔径（镜口率，numericaperture）。镜口角总是要小于180˚，所以sina/2的最大值必然小于1。2）显微镜总放大率（Mt）=物镜放大率×目镜放大率×摄影透镜放大率；有效放大率=物镜数值孔径的500-1000倍，故需根据物镜选配适宜的目镜。5．显微镜的使用1）光路合轴：镜检与摄影前，使照明光线与显微镜光轴合一即为光路合轴，整个过程涉及到聚光器调中和光源灯丝调中两部分，详细过程参阅教材。2）光阑的调节：视场光阑用于控制照明光束可以限定视场大小；孔径光阑用于限定聚光器孔径大小。调节时以视场光阑内缘外切孔径光阑为基准。3）各种特殊光学构件的安装、调试和使用（以BX-50系统显微镜为例）OLYMPUSBX50系统显微镜组成部分OLYMPUSBX50光强预置旋钮粗细准焦旋钮激发模块万能聚光镜孔径光栏拉杆万能聚光镜视场光阑调节环光路合轴调中①转动聚光镜高度升降旋钮把聚光镜升高到最高位置；②放入样品，将DIC、起偏器等光学附件移出光路，聚光镜转到明场上；③用4X或10X物镜聚焦，调至清晰；④视场光阑打至最小；⑤通过调节聚光镜升降旋钮下降聚光镜，使视场中出现清晰正多边形图像；⑥通过调节聚光镜中心调节旋钮，把正多边形图像移至视场中心位置；⑦逐步打开视场光阑，如正多边形与视场边缘内切，则聚光镜已正确对中；⑧实际观察中，稍加大视场光阑，使它的图象刚好与视场外切即可。⑤⑥⑦⑧光路合轴调中过程调节装置二）暗视野显微镜特殊部件：暗视野聚光器/暗视野光挡1．由于聚光器构造的特殊性，导致直射光线不能进入视野，此时视野黑暗。光线斜向照射时，样品产生散射光，一部分散射光线可以进入视野，在黑暗视野中样品边缘明亮。2．暗视野光档：光挡直径取决于物镜数值孔径，光挡恰好能挡住物镜通光孔径。另一个问题是暗视场聚光器的调中。暗视野光挡暗视野显微镜调节使用•开启照明光源•明场（BF）聚焦•转动万能聚光镜转盘至DFA•起偏器拉出光路•检偏器拉出光路•调节孔径光栏至可见样品•调节载物台使样品聚焦•取下目镜，观察物镜外缘，调节并对中暗场环装置；•装好目镜观察暗场图像，重复对中直至获得光学暗场效果图像•上下移动聚光镜直到获得均匀的暗场照明•将视场光阑开大到获得均匀亮度的程度三）倒置显微镜光源在上，物镜在下，光路设计与普通显微镜正好相反，经常用于观察工作距离较大的样品，如观察培养的活细胞。四）相差显微镜部件构成：环状光阑，相差物镜1．这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。光线经环状光阑投射样品的直射光和衍射光透过物镜相差板时，把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4λ（波长），如果再增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后相互干涉加强，振幅增大或减小，提高反差，造成不同的反差效果。2．聚光器调中，需要借助调中望远镜调中。相差物镜对中望远镜相差显微镜调节使用•开启照明光源•明场（BF）聚焦•转动万能聚光镜转盘至Ph（X），使匹配的环状光阑进入光路•选择与聚光镜相匹配的同型物镜Ph（X）•起偏器拉出光路•检偏器拉出光路•打开孔径光阑（孔径光阑太小中央可能产生眩光）•对样品聚焦，取下目镜（可换上调中望远镜,CT），调节环状光阑对中螺丝，使亮环和暗环在视场内重叠，（更换不同倍率物镜需重复调节）•取下对中望远镜，换上目镜观察（可插入绿色干涉滤色片，以增大反差）。五）偏光显微镜部件构成：起偏器+检偏器偏光显微镜用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等等。和普通显微镜不同的是：其光源前有起偏器，使进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器。检偏器偏振方向与起偏器垂直时则为正交偏光镜，这种显微镜的载物台一般是可以旋转的，当载物台上放入单折射的物质时，无论如何旋转载物台，由于两个偏振片是垂直的，显微镜里看不到光线，而放入双折射性物质时，由于光线通过这类物质时发生偏转，因此旋转载物台便能检测到这种物体。简易偏光显微镜调节使用•开启照明光源•明场（BF）聚焦•起偏器推入光路•检偏器（U-ANT）推入光路•调节起偏器旋转旋钮以获得暗场（正交尼科尔位置）并固紧旋钮•调节孔径光栏与光照强度至最佳效果（关小孔径光阑可增大图像反差）起偏器拔出状态视场光阑调节环检偏器拔出状态六）微分干涉差显微镜部件构成：起偏器+DIC棱镜+DIC滑行器+检偏器偏振器装在聚光器的前面，使光线发生线性偏振，聚光器前的DIC棱镜可将一束光分解成偏振方向不同的两束光（x和y），二者成一小夹角。聚光器将两束光调整成与显微镜光轴平行的方向。最初两束光相位一致，在穿过标本相邻的区域后，由于标本的厚度和折射率不同，两束光产生了光程差。在物镜的后焦面处安装了第二个DIC棱镜，即DIC滑行器，它把两束光波合并成一束。这时两束光的偏振面（x和y）仍然存在。最后光束穿过第二个偏振装置，即检偏器，检偏器与起偏器的方向成直角。检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束光，从而使二者发生干涉。于是在灰色的背景上，标本结构呈现出亮暗差，成像效果有浮雕立体感。为了使影像的反差达到最佳状态，可通过调节DIC滑行器的纵行微调来改变光程差，改变影像的亮度，使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象，三维立体感明显。微分干涉差显微镜调节使用•开启照明光源•明场（BF）聚焦•起偏器推入光路•DIC滑座（附检偏器）推入光路，固紧螺丝•顺时针把DIC棱镜控制钮旋转到头•取下目镜可见物镜外缘，同时调节起偏器旋钮至黑色条纹最黑的位置（若为两条黑纹，起偏器旋转90º，以使只可见一条黑色条纹）固紧起偏器旋钮；•目镜复位，转动万能聚光镜转盘至DP（DIC棱镜）进入光路•样品聚焦（样品要表面干净），调节孔径光栏与光照强度至最佳浮雕效果（调节视场光阑与视场外切，缩小孔径光阑可增大反差）•旋转DIC调节钮可调节背景干涉色，灰色到品红色连续变化（100-600nm)•背景黑色时为类暗场效果，灰色则获得最大反差的三维图像，品红色则很小的光学延滞都可观察到颜色变化，如结合可旋转载物台则干涉差的方向灵敏性可表现出来。DIC滑行器（U-DICT），上附检偏器（U-ANT或U-AN）棱镜控制旋钮DIC显微镜下的硅藻七）荧光显微镜1．短波光照射样品导致荧光分子被激发，分子能级跃迁，以光子的形式释放能量。2．光源：高压汞灯，使用时需要预热十五分钟，断电后十分钟内不能重启。3．滤色镜：包括激发光滤镜和阻断滤镜。4．汞灯使用前需聚焦调中。激发模块紫外防护罩汞灯汞灯调中检验器①为了延长高压汞灯的使用寿命，一旦启动，不能在少于15分钟内关闭。关闭高压汞灯后，至少10分钟后才能再次启动。②转动转盘或插入滤光片时始终要停在听到卡嗒声处。如果偏离这个位置，遮光板会由于过热而变形。荧光显微调节装置荧光显微镜使用注意事项•1.紫外光有害，注意保护眼、皮肤•2.荧光弱，曝光时间长，需注意防震•3.保护标本，避免长时间曝光对标本的照射•4.标本制作过程中要注意清洁、环境干净•5.暗室条件八)电子显微镜电子显微镜与光学显微镜的成像原理基本一样，所不同的是用电子束作照明源，用电磁场作透镜，放大倍数最高可达近百万倍。另外，由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的标本须制成厚度约50nm左右的超薄切片。透射电子显微镜实验报告•简要阐述光学显微镜各种显微功能的光路原理和调节使用方法；•各种光学显微镜的使用注意事项。