实验一微藻培养基配制

实验一微藻的培养基配制一、实验目：掌握微藻的培养基配制方法。以海水单胞藻培养液通用配方“f/2”为例二、实验原理藻类的培养液必须具备藻类的生长繁殖所需要的各种营养元素，并且营养盐的比例应该符合藻类生长繁殖的需要。不同种类的微藻对营养盐的质和量的需求不同，各有其特殊性，因此，制定某种微藻的一个培养液配方时，首先必须进行一系列的试验，了解这该种藻类对营养的要求，并在使用中验证配方的效果，加以改进，使配方达到更理想的水平。藻类对营养盐的需求也有很多共同点，因而一些培养液配方（如F/2）可应用于多种藻类的培养。进行微藻培养时，可根据培养藻类对营养的要求，选用合适的配方，在消毒水中按配方加入各种营养物质配成。所加肥料应保持清洁，某些不清洁肥料必须消毒，预防敌害生物通过肥料污染。绿藻培养液配方：①海洋三号扁藻培养液（海洋研究所，1960）：NaNO30.1g2Na3C6H5O7﹒11H2O0.02gK2HPO40.01gFe(SO4)3(1%溶液)10滴海水1000ml②亚心形扁藻培养液（湛江水产学院）：NaNO30.05g维生素B12200mμgKH2PO4(1%溶液)0.005g人尿2mlFeC6H5O70.2ml维生素B1200μg海水1000ml培养亚心形扁藻及其他绿藻使用，多用于小型培养和中继培养，如能加入海泥抽出液20ml，效果更好。硅藻培养液配方：①艾伦-内尔森（Allen-Nelson）培养液{Allen，E.J.etal（1910）}：A.KNO320.2g纯水100mlB.Na2HPO4.12H2O4.0gCaCl.6H2O4.0gHCl（浓）2.0ml纯水80mlFeCl3（溶液）2.0mlB液的配制法：先把氧化钙4g溶解于40ml纯水中。另外把磷酸氢二钙4g溶解于40ml纯水中，再把三氯化铁溶融液2ml，缓慢滴入，摇动，产生白色沉淀，加热，缓慢滴入浓盐酸2ml，沉淀的白色沉淀即重新溶解。把以上两溶液混合。使用时，取A液2ml和B液1ml，加入1000ml海水中，充分混合后加热消毒，消毒后静置24h，然后将上层清夜倒出使用。培养液是根据培养液配方配制的。为了减少每次称量的麻烦，固体的营养元素一般都配成母液（如浓缩1000倍的母液），在使用时，只要吸取一定的量加入培养液中即成。主要营养元素可以单项营养元素配成母液，也可以分成若干组，每组2种或多种营养元素同配在一起。微量元素和辅助生长有机物质也多种组合在一起，配成母液。在浓营养溶液中一般生物因不能忍受而死亡。三、实验材料及用具1、器材电炉；灭菌锅；pH计500ml试剂瓶（每组5个）；玻棒、500ml烧杯、50ml容量瓶（每组一个）/牛皮纸、细绵绳2、试剂：蒸馏水、海水各种试剂NaNO3;NaH2PO4；FeCl3EDTA；Na2SiO3.9H2O；盐酸硫铵素(VB1)；BiotinVH三、实验步骤（一）F/2(+Si)培养基母液的配制（用去离子水配制）1.A液500ml1000倍NaNO337.5g;NaH2PO42.5g2.B液500ml1000倍Fe-EDTA2.5g(FeCl31.6g+EDTA0.9g)3.C液500ml1000倍Na2SiO3.9H2O10g4.D液500ml1000倍盐酸硫铵素(VB1)5mg(试剂50mg/ml取100μl)BiotinVH0.025mg(试剂0.1mg/ml取250μl)VB120.025mg(试剂0.25mg/ml取100μl)先用维生素分别用纯水溶解混合，稀HCl将pH调到4.5~5.0，最后用纯水稀释至1升。膜过滤后冰冻保存。5.E液500ml1000倍CuSO4.5H2O0.0098mg；ZnSO4.7H2O0.022mgCaCl2.6H2O0.01mg；MgCl2.4H2O0.180mgNa2MoO4.2H2O0.0063mgA、B、D、E高压灭菌备用（三）F/2培养基配制1000ml(1升)F/2(+Si)培养基=1000ml(1升)过滤灭菌海水+1mlA液+1mlB液+1mlD液+1mlE液(+1mlC液)注意：煮沸的海水放置凉后（50度以下）再加母液，否则会出现沉淀。（二）海水处理沉淀——砂池过滤——（抽滤）——灭菌（海水放于三角瓶中，置于电炉上煮沸，可杀来一般细菌）实验二单细胞藻类的培养一、实验目的掌握单细胞微藻的实验室培养(藻种培养)方法，细胞生长曲线观察。二、实验材料及用具1、实验材料：小球藻（500ml）、等鞭金藻、扁藻2、实验仪器：可见分光光度计、显微镜（1部/组）、血球计数板（一个/组）、电炉、灭菌锅、pH计、500ml烧杯（1个/组）、胶头滴管（3支/组）、250ml锥形瓶（每组3个）、牛皮纸、细绵绳3、试剂：蒸馏水、海水、碘化钾三、实验步骤1、培养基配制：见实验一2、接种：一般培养的接种量为1/3～1/5.3、计数：分光光度计测定500nm（OD500）和750nm（OD750）吸光值；细胞计数板计数。4、每天测定一次，分别绘制以OD值和细胞绝对数目为纵坐标、时间为横坐标的生长曲线，分析细胞数目与OD500和OD750的相关性。5、观察并描述微藻不同生长时期的特点小球藻扁藻球等鞭金藻1、血球计数板计数方法：（1）搅拌：由于藻类细胞在培养液中分布不均匀，所以在取产前必须进行搅拌，搅拌后立即取样。（2）固定、稀释：运动细胞需加碘液杀死才能计数。如细胞浓度过大，计数困难，需把水样稀释到适宜的程度。（附：鲁哥氏液（Lugol‘sSolution）又称碘液，常用的配方是：将6克的碘化钾溶于20毫升水中，待完全溶解后加入4克碘，摇荡，待碘完全溶解后，加入80毫升蒸馏水，贮存在棕色试剂瓶内。）（3）计数板与盖玻片洗净擦干――盖好盖玻片――摇荡藻液――吸取藻液（干的微吸管）――迅速加样――1分钟后低倍镜下计数－计数任何对角两大格（加盖玻片后每一大格即形成一个体积为0.1立方毫米的空间），然后取其平均值。每个样品须重复计数两次。1毫升水体藻细胞＝计算平均值×10,000×藻稀释倍数2、分光光度计定量法比色皿用75％酒精消毒后，将藻液摇匀，倒入2/3体积，在两个波长下测定吸光度值。注意分光光度计测定前要调零和调满度。作业:1、分别绘制以OD值和细胞绝对数目为纵坐标、时间为横坐标的生长曲线(三张图)，分析细胞数目与OD500和OD750的相关性（两次相关性），比较哪个波长下的密度值更能代表藻细胞数目。5、观察并描述微藻不同生长时期的特点。实验三藻类细胞叶绿素的提取和细胞色素的观察一、实验目的掌握大型和微型海藻叶绿素测定方法。观察比较不同门藻类的叶绿素的吸收光谱。叶绿素含量是衡量大型海藻生长状态的指标之一。浮游植物叶绿素含量，可用来初步估量浮游植物的光合作用能力，并进行估量水域初级生产力。也适用于评价实验室单种生长状况。二、实验材料及用具1、实验材料：海带、裙带菜、紫菜、小球藻、球等鞭金藻等,选4种藻2、实验仪器：紫外分光光度计(208实验室)3、实验器材：研钵（每组一套）、15ml离心管（每组4支-依藻种类定）、15ml刻度试管（每组4支）、0.45m的滤膜（每组3个），抽滤装置，离心机（或用20ml针管和滤膜器）4、试剂：丙酮（分析纯）、MgCO3三、实验步骤1、抽滤：减压过滤5ml的藻类培养液到玻璃纤维滤片上，约加0.1gMgCO3细粉，使均匀覆盖于薄膜上，倒入水样抽滤，注意避免高温、强光及压力过高，水滤完后，应继续抽气数分钟，以尽量吸尽滤膜上水分。2、储存：将折膜放入样品储存装置中，置黑暗、干燥、低温处保存。3、研磨和提取：把滤膜放到一个组织研磨管内的底部，加入2－3ml的90％丙酮，把杵插入管内，研磨，在弱光下将滤得的试样研磨1到2min，再用5ml的90％丙酮把杵上和研磨管内的东西洗入15ml的有螺旋盖的离心管内，静置于暗处10min，使色素充分被提取。（观察叶绿素荧光）4、离心：（2000g）5min，离心，5、测定：将上清液用90％丙酮定容25ml，在分光光度计上，用1cm的比色皿分别读取750nm、663nm、645nm、630nm波长的吸光度，并以90％的丙酮作校正吸光度测定。6、计算：分别从663、645、630nm时的光密度值，减去750nm时的光密度值，再除以液槽光程（厘米），即为D663、D645、D630的值。下式计算叶绿素在90％丙酮中的含量。联合国教科文组织国际工作组推荐公式Chla（mg/ml）=11.64*D663-2.16*D645+0.1D630Chlb（mg/ml）=3.94*D663+20.97*D645-3.66D630Chla（mg/ml）=5.53*D663-14.81*D645+54.22D6307、叶绿素吸收光谱的测定：将提取的叶绿素放于(石英)比色皿中，用紫外分光光度计测定400nm-750nm波段的吸收光谱。三、作业：1、计算几种藻类的叶绿素含量2、比较并说明不同藻类的叶绿素吸收光谱有何异同，并分析原因实验四微藻的分离方法---微吸管分离法一、实验目的1、单胞藻类的培养，首先需要有藻种。原始的藻种是从天然水域混杂的生物群中，运用一定的方法，把所需要的个体，分离出来，而获得单种培养。2、若藻种受敌害生物及其他杂藻的污染也要通过分离进行纯化。本实验的目的是使学生了解单胞藻的分离方法，掌握单细胞藻类的微吸管法分离技术。二、实验材料及用具1、实验材料：扁藻，球等鞭金藻或小球藻2、实验仪器：显微镜3、实验器材：细玻璃管或毛细管；载玻片；小试管；脱脂棉；纱布；酒精灯4、试剂：灭菌海水；F/2培海水养基三、实验步骤1、采样：水样可取自天然水域、养殖池、湖泊、溪流及特殊水域环境等。此外，培养水生生物的或储水的各种容器、水池，均可能生长大量浮游或附着藻类，也是采样的理想场所。2、拉制微吸管：选直径5毫米的细玻璃管，或者其它任何适合拉成毛细管的巴氏滴管，用镊子夹住滴管的前端，放在酒精喷灯的外焰上，直到玻璃变软，迅速移离火焰，同时快速拉成毛细管。4、将装有藻细胞的试管置于适宜的条件下培养。三、实验步骤3、分离：镜检待分离的藻液，调藻液浓度为5-6个藻细胞为宜，在已灭菌的载玻片上滴加6滴消毒培养液，另取一载玻片滴一滴稀释的待分离藻液，在显微镜下用微吸管吸取所需的藻细胞，放在第一滴消毒水中，清洗，再用微吸管吸取所需的藻细胞放在备有培养液的试管中。实验五微藻的分离方法---平板分离法一、目的：学生掌握平板分离单藻种的方法。适用于能在固体培养基上生长的种类。二、实验材料：F/2海水培养基；琼脂糖；玻璃棒；培养皿（每个同学一副）；干燥箱、高压灭菌锅、电炉；封口膜三、实验步骤：1、平板培养基的制备：该培养基的制备包括调配、融化、分装、灭菌四个步骤。调配：按分离种类的需要选用合适的营养盐配方配成培养液，加1%琼胶（又称冻粉），琼胶剪成细片，加入培养液中浸泡12小时。融化：把培养液加热，不断搅拌，使琼胶完全融化。在加热过程中，水分要蒸发不少，在加热完毕应以淡水补充蒸发掉的水分。分装：稍冷后即分装于培养皿中，装的厚度依培养皿大小而定，在0.3-0.5厘米之间。三、实验步骤：2、平板分离方法：经灭菌的固体培养基冷却后，培养基凝固成固体状态，即可进行分离。（显微观察待分离的藻液并调节藻液浓度为1000-5000个/毫升）划线法：把一个金属接种环在酒精灯火焰上灭菌后，蘸取需要分离的藻液轻轻地在平板上划折线。喷雾法：将需要分离的藻液稀释，装入经消毒过的小型喷雾器中，打开培养皿盖，把藻液喷射在培养皿表面形成分布均匀的一薄层水珠。涂布法：滴1-2滴自然采集物于琼脂的边缘。用一弯玻璃棒（将棒浸入70%酒精溶液，放在火焰上点燃并移离火焰；重复几次。）在无菌条件下将滴在琼脂上的自然采集物滴平涂在琼脂表面上。3、将待分离的藻液喷在固体培养基上，然后盖好，放在光亮处培养。实验六褐藻胶的提取