感染性疾病实验室诊断

感染性疾病实验室诊断LaboratoryDiagnosisofInfectiousDiseases目的要求1．掌握感染性疾病常用的实验室检测项目及其临床意义和评价2．熟悉引起血流、中枢神经系统、呼吸系统、胃肠道、泌尿系统感染的常见病原体与常见疾病及病原学检查3．了解当今感染病的特点、感染类型第一节概述感染性疾病：病原体宿主疾病病原体（细菌、真菌、病毒、寄生虫）一、当今感染病的特点1感染性病原体的种类不断发生变迁2宿主的免疫防御能力下降3内源性感染与条件致病菌的感染增加二、感染类型（一）按病原体分类1.传统病原体感染细菌：病毒：真菌：寄生虫2.新发病原体：SARS冠状病毒新甲型H1N1流感病毒高致病性禽流感病毒(二）按疾病特征分类1.病原体被清除2.隐性感染(covertinfection)，亦称亚临床感染一般占人群的90％或以上3.显性感染(overtinfection)又称为临床感染发病快慢和病程长短：急性感染和慢性感染感染部位及性质：局部感染和全身感染全身感染：①菌血症②败血症③毒血症④脓毒血症(三）按病原体来源外源性感染内源性感染三、感染性疾病的实验诊断（一）一般实验检测WBC常规检查C-反应蛋白（CRP）血清降钙素原（PCT）器官功能改变的检测（二）病原学实验诊断临床病原体检查目的明确感染病原体指导治疗，预防，判断预后第二节感染性疾病的常用病原学检测病原学检测基本程序①正确、规范采集和运送标本②显微镜对标本或组织中的病原体的形态学检查③病原体的分离培养和鉴定④用免疫学技术对病原体抗原或相应抗体的检测⑤用分子生物学方法对病原体特异性基因的检测一、临床标本的采集与处理（一）标本采集的一般原则1.早期病程早期、急性期或症状典型时使用抗生素前2.无菌采集应无污染，严格进行无菌操作采集的标本均应盛于无菌容器内3.根据目的菌的特性用不同的方法采集4.适量标本,不同病程采集不同部位标本5.安全采集做好标记（二）标本的处理原则：保持病原体活力，保持标本不被污染，也不污染环境1.尽快送检对环境敏感的细菌应保温立即送检,其他所有采集后最好在2小时内送检,不能及时送检,应注意保存2.必须注意安全防护,切勿污染环境3.厌氧性标本应放在专门的运送瓶或试管内运送，有时可直接用抽取标本的注射器运送二、检验方法查病原体：形态与结构检查分离培养和鉴定检测病原体成分（抗原和核酸）检测患者血清中特异性抗体代谢产物（生化试验）毒素：外毒素、内毒素（一）直接显微镜检查（形态与结构检查）1.染色标本检查法染色标本：了解病原体的形态、染色性或观察宿主细胞内包涵体临床意义：1.镜检可以了解有无病原体及大致的量2.根据细菌形态、结构和染色性有助于对病原体的初步识别和分类3.通过形态学检查可得到初步诊断，对临床早期诊断和治疗疾病有一定的参考意义如CSF找到抗酸杆菌，应初步考虑结核分枝杆菌感染革兰阳性革兰阴性抗酸染色培养在McCoy细胞的沙眼衣原体吉姆萨染色的McCoy细胞，含大衣原体包涵体，使部分细胞核不清楚。（吉姆萨染色,放大1000倍）狂犬病毒可于细胞浆中可形成嗜酸性包涵体新生隐球菌假丝酵母菌（白色念珠菌）革兰染色墨汁负染2.不染色标本1)检查生活状态下细菌的动力及运动状况2）螺旋体由于不易着色并有形态特征对某些病原菌作出初步鉴定，如霍乱弧菌常用方法压片法(压滴法)或悬滴法暗视野显微镜或相差显微镜检查体癣皮屑可见关节孢子HAVparticlesfoundinfecalextractsbyimmunoelectronmicroscopyHAV形态电镜图粪便标本负染X2000003.直接电镜检测EM免疫电镜技术IEM（二）分离培养和鉴定分离培养是微生物学诊断的金标准，是最可靠的传统诊断技术临床意义：1.明确感染病原体2.为临床提供体外抗微生物药物敏感试验结果药物敏感试验培养特征形态特征生化试验血清学试验毒力试验1.细菌的分离培养和鉴定培养特征细菌学诊断形态特征血清学鉴定大肠埃希菌对照-吲哚试验枸椽酸盐利用试验大肠埃希菌甲基红试验VP试验大肠埃希菌大肠埃希菌对照-对照+对照+生化试验一）病毒分离培养1．动物接种（二）病毒的分离与鉴定2．鸡胚培养卵黄囊接种、绒毛尿囊膜接种尿囊接种及羊膜腔接种敏感动物合适部位3．组织细胞培养：目前培养病毒应用最广的方法（1）原代和次代细胞培养（2）二倍体细胞培养（3）传代细胞培养识别病毒在培养细胞中增殖病毒在培养细胞中增殖的指标1）细胞病变:细胞病变效应（CPE）、包涵体2）红细胞吸附（hemadsorption）细胞病变效应（CPE）：病毒感染细胞后引起的细胞病变，可出现细胞圆缩、裂解或细胞肿大、数个细胞融合成多核巨细胞等。二）病毒鉴定Cytopathiceffect(CPE)ofprimarysevereacuterespiratorysyndrome–associatedcoronavirusstrain48h72h36hN病毒学诊断常用鉴定试验：中和实验血凝抑制实验virus红细胞凝集抑制（HI）试验原理：病毒病毒（特异性抗体）++红细胞红细胞凝集不凝集血凝现象血凝抑制现象ConfocalimageshowingamacrophageinthelungofamouseinfectedwithSARS-coronavirus.DoubleimmunofluorescencelabelsthemacrophageinredwithantibodiesagainstMac-2andviralproteiningreenwithantibodiesagainstspike.（三）真菌的分离培养－常用培养基沙保（Sabourud）培养基真菌的菌落有两种：酵母型菌落和丝状菌落酵母型菌落丝状菌落新生隐球菌假丝酵母菌（白色念珠菌）（三）鉴定1.糖(醇)类发酵试验37℃孵育，观察糖发酵情况。2.同化碳源试验含菌生理盐水与已融化的固体同化碳源培养基(45℃)混合，然后在培养基上分别加糖，置25℃孵育观察结果。若24h后无变化可重复加糖。如能同化周围有生长圈，否则无生长。3.同化氮源试验同化碳源试验相同，但需用无氮源的培养基，不要加糖类，而加入硝酸钾。检测程序（三）病原体抗原与抗体的检测病原体抗原成分的检测：早期诊断现症感染特异性IgM：早期诊断现症感染特异性IgG：双份血清的滴度呈4倍或4倍以上升高，考虑病原体现症感染*排除交叉反应的影响夹心ELISA(检测抗原）间接ELISA(检测抗体）（四）病原体核酸检测1．核酸杂交技术通过已知序列的探针与病原体的核苷酸杂交，用以了解病原体的有无。Southern印迹杂交（Southernblot）Northern印迹杂交（Northernblot）斑点杂交（dotblot）原位杂交（insituhybridization,ISH）2．PCR扩增病原体微生物特异的DNA或RNA片段常用于检测不能在体外培养或目前的培养技术不敏感、费用高昂或耗时长的病原体核酸分子杂交(nucleicacidmoleculahybridization)genomeprobe32P35S3H125I生物素地高辛酶genomegenomegenomeprobeprobeprobe检测方法：放射自显影底物显色化学发光2．PCR3.生物芯片技术核酸检测结果评价检测病原体微生物最灵敏的方法早期诊断现症感染假阳性与假阴性（五）细菌毒素的检测1.内毒素的测定常用方法：鲎试验（limulustests）内毒素与鲎试剂接触时，可激活凝固酶原，使可溶性的凝固蛋白原变成凝胶状态的凝固蛋白内毒素(鲎试剂)凝固酶原凝固酶凝固蛋白原凝固蛋白(凝胶)2.外毒素的测定（1）体内毒力试验细菌外毒素对机体的毒性作用，可被相应抗毒素中和，若先给动物注射抗毒素，然后再注射外毒素，则动物不产生中毒症状。（2）体外毒力试验以细菌外毒素的特异性免疫血清为抗体与被检细菌外毒素(抗原)进行抗原抗体反应，来检测外毒素，从而鉴定细菌是否产生该种毒素。白喉棒状杆菌的Elek平板毒力测定（３)免疫学方法：如ELISA法葡萄球菌肠毒素、肠产毒型大肠埃希菌LT及ST等的测定（4）分子技术Elek平板试验ElekTest沉淀线(阳性)含白喉抗毒素滤纸片白喉杆菌菌苔标准产毒株(六）体外抗菌药物敏感试验常用方法纸片扩散法（Kirby-Bauertest）稀释法（dilutiontest）E试验法（Etest）杀菌试验体外联合药物敏感试验第三节常见感染性疾病的实验诊断一、血流感染（一）引起血流感染常见微生物与常见疾病常见微生物革兰阳性球菌：葡萄球菌、链球菌、肠球菌革兰阴性杆菌：大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、沙门菌真菌：病毒：HBV、HCV血流感染常见疾病细菌：菌血症、败血症、脓毒血症真菌：真菌血症病毒：病毒血症(二)血流感染的病原学检查1.血液标本采集与运送采血时间：寒战或体温高峰到来之前0.5~1hr24小时内采集2~3次采血量：成人5~10ml，婴儿和儿童为1~2ml运送：血液置于含抗凝集聚茴香脑磺酸钠无菌瓶中送检血液标本的采集方法2、细菌学检验（1）检验程序bloodaerobiccultureanaerobiccultureBacteriagrowthBacteriagrowthProcedureforbacterialdetectioninbloodDirectmicroscopicexaminationCulture(BA)colonycharacteristicsstainofsmearandmicroscopicexaminationBiochemicaltestSerologicalindentificationantibioticsusceptibilitytestDirectmicroscopicexaminationCulture(BA)anaerobicculturereportFirstreportEndotoxindetection（2）临床意义阳性—确诊血流感染阴性：培养7天，未见细菌生长注意区分致病菌和污染菌2、真菌学检验（1）检验程序bloodaerobiccultureBacteriagrowthProcedureforfungaldetectioninbloodDirectmicroscopicexaminationCulture(SabouraudagarorCHROMagar)colonycharacteristicsstainofsmearandmicroscopicexaminationBiochemicaltestSerologicalindentificationantibioticsusceptibilitytestPNA-FISHPCRreportFirstreportSerologicaldetection（2）临床意义初报：增菌培养——真菌孢子终报：分离培养鉴定——菌株协助诊断：β-D-1,3葡聚糖（BDG）半乳甘露聚糖（GM）二、中枢神经系统感染（一）引起中枢神经系统感染常见微生物与常见疾病常见微生物脑膜炎奈瑟菌、结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、大肠埃希菌新生隐球菌、假丝酵母菌乙型脑炎病毒，单纯疱疹病毒中枢神经系统感染常见疾病脑膜炎、脑炎、脑脓肿（二）中枢神经系统感染的病原学检查1.标本的采集与运送脑脊液临床医生采用腰椎穿刺，抽取2-3ml，置于无菌容器中脑脊液应立即保温送检或床边接种，不能暂时保存于冰箱中2.细菌学、真菌学检验（1）检验程序CSFBacteriacultureProcedureforbacterialandfungaldetectioninCSFGramstainSabouraudagarcolonycharacteristicsstainofsmearandmicroscopicexaminationBiochemicaltestantibioticsusceptibilitytestreportFirstrepor