第7章色谱分离技术

一、色谱分离技术的概念色谱（chromatography）分离技术是一类分离方法的总称，又称色谱法、层析法、层离法等。它是利用不同组分在固定相和流动相中的物理化学性质的差别，使各组分在两相中以不同的速率移动而进一步分离的技术。第7章色谱分离技术第一节概述色谱现象In1903，俄国植物学家MichaelTsweett’sWork(seeBer.Deut.Botan.Ges.,1906;24:384).Chromatography=(chromatus=color,graphein=towrite).图示固定相——CaCO3颗粒流动相——石油醚色带一、色谱过程色谱柱检测器色谱图组分在色谱柱内运动溶质浓度分布柱内：谱带柱后：色谱峰色谱仪1.定义色谱是根据混合物中溶质在互不混溶的两相间分配行为的差别而引起移动速度的不同而进行分离的方法。2.色谱法的特点分离效率高可选操作参数多应用范围广高灵敏度的在线检测快速分离与过程自动化操作在色谱过程中，分配系数大的溶质在固定相上存在的概率大，随流动相移动速度小。由此，溶质之间由于移动速度的不同而得到分离。色谱操作中互不混溶的两相分别称为固定相和流动相。固定相填充于柱内形成固定床，在柱的入口端加入料液后，连续输入流动相，料液中溶质在流动相与固定相之间扩散传质，产生分配平衡3.色谱一般过程在色谱法中，表面积较大的固体或附着在固体上且不运动的液体，静止不动的一相（称为固定相；自上而下运动的一相（一般是气体或液体）称为流动相。二、色谱分离系统的组成根据分离时一次进样量的多少，色谱分离的规模可分为色谱分析规模(小于10mg)、半制备(10~50mg)、制备规模(0.1~10g)和工业生产规模(10g)。色谱分离的规模小，但产值高。三、色谱分离技术的分类超临界流体色谱—流动相是在接近它的临界温度和压力下工作的液体三、色谱法的分类根据流动相的相态不同:气相色谱—以气体作流动相液相色谱—以液体作流动相—固定相涂敷在玻璃或金属板上—薄层色谱三、色谱法的分类根据固定相的附着方式分类—液体固定相涂在纸上—纸色谱(平板色谱)—固定相装在圆柱管中—柱色谱三、色谱法的分类吸附色谱法分配色谱法离子交换色谱法凝胶色谱法亲和色谱法按分离机理不同，可分为：三、色谱法的分类根据操作压力的不同分类：低压色谱：操作压力0.5MPa中压色谱：操作压力0.5～4.0MPa高压色谱：操作压力4.0～40MPa色谱法的缺点是处理量小、操作周期长、不能连续操作。四、色谱法的特点(1)分离效果高(2)应用范围广(3)选择性强(4)设备简单第二节吸附色谱法吸附色谱法(adsorptionchromatography，AC)是靠溶质与吸附剂之间的分子吸附力的差异而分离的方法。固体吸附剂，如有较强极性硅胶、中等极性氧化铝、非极性炭及特殊作用的分子筛等。吸附色谱是靠溶质与吸附剂之间的分子吸附力的差异而分离的方法。吸附力主要是范德华力，有时也可能形成氢键或化学键。吸附法的关键是选择吸附剂和展开剂。1.基本原理吸附色谱分离过程示意图下列三个化合物用硅胶吸附色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯（95：5）洗脱，判断三者流出色谱柱先后顺序。ABC由先到后：C→B→AOHOCOCH3O举例：平衡系数（分配系数、吸附系数、选择性系数）K=cs/cmcs—固定相中的浓度；cm—流动相中的浓度影响K的因素：被分离物质本身的性质、固定相和流动相的性质、色谱柱的操作温度。各物质K差异越大，色谱分离效果越理想。阻滞因数（比移值）斑点到原点的距离Rf值=————————溶剂前沿到原点距离阻滞因数①0≤Rf≤1Rf越大，溶质随流动相移动快，被洗脱速率也就越快。②当Rf=1，此种溶质不溶于固定相，随流动相以同样的速率移动。③当Rf=0，此种溶质不溶于流动相，而被吸附在固定相上。选用吸附色谱法分离化合物时，必须首先了解被分离化合物的性质，然后选择合适的吸附剂和展开剂。被分离化合物、吸附剂和展开剂三者关系配合恰当才能得到较好的分离效果。2.吸附剂与展开剂薄层色谱法选择的主要吸附剂为氧化铝、硅胶和聚酰胺。色谱用的吸附剂要求一定的形状与粒度范围，不同吸附剂用于分离不同类型的化合物。吸附剂还必须具有一定的活度，活度太高或过低都不能使混合物各组分得到有效的分离。（1）薄层色谱的吸附剂与展开剂展开剂基本原则主要有两个：①展开剂对被分离组分有一定的解吸能力，但又不能太大。②展开剂应该对被分离的物质有一定的溶解度。展开剂常用溶剂极性次序为：己烷环己烷四氯化碳甲苯苯氯仿乙醚乙酸乙酯丙酮正丙醇乙醇甲醇水冰醋酸吸附剂应有最大的比表面积和足够的吸附能力，它对欲分离的不同物质应该有不同的解吸能力；与洗脱剂、溶剂及样品组分不会发生化学反应；吸附剂颗粒均匀，操作过程中不会破裂。（2）柱色谱的吸附剂与洗脱剂吸附剂的选择洗脱剂的选择原则上要求所选的洗脱剂纯度合格，与样品和吸附剂不起化学反应，对样品的溶解度大，粘度小，容易流动，容易与洗脱的组分分开。洗脱剂的选择常用的洗脱剂有饱和的碳氢化合物、醇、酚、酮、醚、卤代烷、有机酸等。选择吸附剂时，可根据样品的溶解度、吸附剂的种类、溶剂极性等方面考虑先用极性小的作洗脱剂，然后换用极性大的溶剂作洗脱剂，使组分容易从吸附柱中洗出。3.影响吸附分离的因素①和功能基极性有关。极性增加的顺序：烷烃、不饱和烃、醚、酯、酮、醛、醇、酚和羧酸，同一类化合物极性基团越多，极性越大。②小分子的化合物比大分子的化合物极性大。③和某些细微结构有关，如氢键、异构体等。二、吸附色谱分离操作及其设备1.薄层吸附色谱分离操作及设备（1）薄层色谱板的制备（2）点样（3）展开（4）显色①干法铺板(软板制备)多用于氧化铝薄层板的制备。在一块边缘整齐的玻璃板上，铺上适量的氧化铝，取一合适物品顶住玻璃板右端。两手紧握铺板玻璃棒的边缘，按箭头方向轻轻拉过，一块边缘整齐、薄厚均匀的氧化铝薄层即成。(1)薄层色谱板的制备干法制板可用于硅胶、聚酰胺、氧化铝等薄层板的制备，但最常用的是硅胶硬板。为使制成的硅胶板坚硬，要加入黏合剂，用硫酸钙为粘合剂铺成的板称为硅胶G板，用羧甲基纤维素钠作黏合剂铺成的板为硅胶-CMC板。(2)湿法铺板(硬板制备)聚酰胺膜多为外购商品。2)点样用一根玻璃毛细管或点样器，吸取样品溶液，在距薄层一端约2cm的起始线上点样，每点间距约2cm，样品点直径一般小于0.5cm。注意点样量要适中，太少时，某些成分不能被检出；太多时容易产生拖尾现象，即每个斑点都拉得很长，互相重叠，不能分开。3）展开展开操作需要在密闭的容器中进行。展开剂配好（2～10mL）倒入层析缸。放置一定时间，待层析缸被展开剂饱和后，再迅速将薄层板放入，密闭，展开即开始，这样可防止边缘效应产生。薄板放入层析缸时，切勿使溶剂浸没样品点。当溶剂移动到接近薄层上端边缘时，取出薄板，划出溶剂前沿。展开方式可分三类：(1)上行展开法最常用就是使展开剂从下往上爬行展开；(2)单次展开法和多次展开法(3)单向展开法和双向展开法薄层板玻璃板上涂吸附剂层SiO2Al2O3上行法薄层板层析缸展开剂层析缸展开剂滤纸条下行法薄层板薄层色谱法(ThinLayerChromatography)4)显色显色也称定位，即用某种方法使经色谱展开后的混合物斑点呈现颜色，以便观察其位置(1)紫外线照射法(4)生物显迹法(2)喷雾显色法(3)碘蒸汽显色法2.吸附柱色谱分离操作及设备洗脱液样品填充物分部收集玻璃柱色谱柱通常用玻璃柱。工业上用金属制造。柱入口端应该有进料分布器，使进入柱内的流动相分布均匀。色谱柱顶端加一层多孔的尼龙圆片或保持一段缓冲液层。柱底部可以用玻璃棉，也可以用砂芯玻璃板，最简单的也可以用铺有滤布的橡皮塞。(1)色谱柱的选择设计柱长时需考虑下列几点：(3)柱越长，长度和内径比越大，就越难得到均匀的填装。大多数色谱柱的长度25cm左右。(1)柱的最小长度取决于所要达到的分离程度(2)较大的柱直径需要较长的色谱柱。①干法装柱在柱下端加少许棉花或玻璃棉，再轻轻地撒上一层5mm厚的干净砂粒，或放置大小合适的玻璃砂芯。打开下口，然后将吸附剂经漏斗缓缓加入柱中，同时轻轻敲动色谱柱，使吸附剂松紧一致将色谱柱用最初洗脱剂小心沿壁加入，至刚好覆盖吸附剂顶端平面，关紧下口活塞。(2)装柱②湿法装柱吸附剂中加入适量洗脱剂调成稀糊状，再把放好棉花或玻璃砂芯的色谱柱下口打开，然后徐徐将制好的糊浆灌入柱子。操作要慢，不要将气泡压入吸附剂中，而且要始终保持吸附剂上有溶剂，最后让吸附剂自然下沉。当洗脱剂刚好覆盖吸附剂平面时，关紧下口活塞。(3)上样①湿法上样把被分离的物质溶在少量洗脱剂中，小心加在吸附剂上层，注意保持吸附剂上表面仍为一水平面打开下口，待溶液面正好与吸附剂上表面一致时，在上面撒一层细砂，关紧柱活塞。②干法上样可选用一种对样品溶解度大而且沸点低的溶剂，取尽可能少的溶剂将其溶解。在溶液中加入少量吸附剂，拌匀，挥干溶剂，研磨使之成松散均匀的粉末，轻轻撒在色谱柱吸附剂上面，再撒一层细砂。(4)洗脱在装好吸附剂的色谱柱中缓缓加入洗脱剂，进行剃度洗脱，各组分先后被洗出。若用50g吸附剂，一般每份洗脱液量常为50mL。现多采用薄层色谱或纸色谱定性检查各流分中的化学成分组成。含单一色点的部分用合适的溶剂结晶；仍为混合物的部分进一步寻找分离方法再进行分离。注意：整个操作过程必须注意不使吸附柱表面的溶液流干。应控制洗脱液的流速。应尽量在短时间内完成一个柱层析的分离。洗脱操作的方式可分为：前沿分析法（迎头法）：将混合物溶液连续通过色谱柱，只有吸附力量最弱的组分最先自柱中流出，其他各组分不能达到分离。置换展开法（顶替法）：利用一种吸附力比各组分都强的溶剂作为洗脱剂，替代结合在固定相上的各组分。处理量大，且各组分分层清楚。洗脱展开法（洗脱分析法）：先将混合物尽量浓缩，引入色谱柱上部，然后用溶剂洗脱，使各组分分离完全。应用最广。三、吸附色谱法的应用主要用于具有不同官能团或具有相同官能团但数目不同的极性化合物及异构体等生物小分子物质的分离分析。第三节凝胶色谱法凝胶色谱是基于分子大小不同而进行分离的一种分离技术，又称凝胶过滤、凝胶渗透过滤、分子筛过滤、阻滞扩散层析或排阻层析。优点：操作方便、不会使物质变性、适用于不稳定的化合物、凝胶不用再生、可反复使用。缺点：分离速度较慢。一、基本原理小分子物质可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。凝胶过滤层析过程示意图小分子大分子凝胶基质凝胶珠二、凝胶过滤介质理想的凝胶过滤介质具有高物理强度及化学稳定性，能够耐受高温高压和强酸强碱，具有高化学惰性，内孔径分布范围窄，珠粒颗粒大小均一度高。目前，常用的有葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。1.葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶是应用最广泛的一类凝胶，国外商品名为Sephadex。它由葡聚糖Dextran交联而得。交联剂在原料总质量中所占的百分数叫交联度。交联度越大，网状结构越紧密，吸水后体积膨胀越少；反之，交联度越小，网状结构越疏松，吸收量越多，吸水后体积膨胀越大。2.琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶来源于一种海藻多糖琼脂，是一种天然凝胶，孔隙度是以改变琼脂糖浓度而达到的。琼脂糖凝胶的化学稳定性不如葡聚糖凝胶。用琼脂糖凝胶进行分离操作的适宜工作条件是在pH为4.5～9，温度0～40℃。琼脂糖凝胶对硼酸盐有吸附作用，不能用硼酸缓冲液。3.聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成凝胶，其稳定性比葡聚糖凝胶好。洗脱时不会有凝胶物质被洗脱下来。在pH2~11范围稳定。缺点是不耐酸，遇酸时酰胺键会水解成羧基，使凝胶带有一定的离子交换基团。三、凝胶过滤介质的选择1.分离范围2.分辨率3.稳定性四、操作方法1.