高三一轮复习课件基因工程1

一、基本工具二、操作程序三、应用四、蛋白质工程专题复习一基因工程1、原核细胞基因结构：基因非编码区：非编码区：调控序列编码区：编码蛋白质终止子：终止转录启动子：启动转录，RNA聚合酶结合识别位点mRNA翻译特定功能的蛋白质转录DNA分子2：真核细胞基因结构：基因非编码区：非编码区：编码区：编码蛋白质终止子启动子前体mRNA外显子和内含子都转录特点：编码区间隔不连续！分为内含子和外显子。编码蛋白质不编码蛋白质剪切掉内含子转录的部分mRNADNA分子启动子与终止子启动子是在非编码区内紧靠转录起点，调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列，它能引导RNA聚合酶与正确的基因部位结合，使转录从起点开始，沿编码区进行。终止子是在非编码区内紧靠转录终点，调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。基因工程基因工程基因拼接技术DNA重组技术==基因工程含义:(1)按照人们意愿,____改造生物遗传特性的技术(2)在__________水平进行操作(3)是在_________进行的人为基因重组定向DNA分子体外1.供体：提供_________。2.操作环境：_____。3.操作水平：_____水平。4.原理：_________。5.受体：表达目的基因。6.本质：性状在_____体内表达。7.优点：克服________________障碍，定向改造生物_____。目的基因体外分子基因重组受体远缘杂交不亲和性状记一记对基因工程的概念的理解1．基因拼接的理论基础（从结构上分析，为什么不同生物的DNA能够重组?）(1)大多数生物的遗传物质是DNA。(2)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。(3)双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。一、基因工程诞生的理论基础2．外源基因在受体内表达的理论基础(1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。(2)遗传信息的传递都遵循中心法则。(3)生物界共用一套遗传密码。DNA重组技术的基本工具工欲善其事,必先利其器.想一想:获得转基因抗虫棉需要做哪些工作呢?实现这一精确的操作过程的工具是什么呢?基因工程之第1节基本工具一、工具与工具酶“分子手术刀/剪刀”：______________“分子缝合针/针线”：______________“分子运输车/运载体”：______________________限制性核酸内切酶DNA连接酶质粒λ噬菌体的衍生物动植物病毒二、分子手术刀——限制性内切酶1、特点：2、结果：识别_________,________特定序列特定切点断开____________键磷酸二酯GAATTCGAATTCGA限制酶•以中轴线双侧的DNA上碱基呈反向对称，重复排列（一般序列长度：6，4，8，5）••如：GAATTCCCCGGG•CTTAAGGGGCCC限制酶所识别的序列有什么特点EcoRⅠ（在G与A之间切割）SmaⅠ（在G与C之间切割）HindⅢ（在A与A之间切割）GAATTCCTTAAGCCCGGGGGGCCCAAGCTTTTCGAA中轴线（特异性）限制酶的识别特点EcoRⅠ黏性末端黏性末端Goback•什么叫黏性末端？被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。SmaⅠ平末端平末端GAATTCGAATTCGAATTCGAATTCGAATTCGAATTC黏性末端平末端3、限制酶作用后产生的末端:_________和______黏性末端CCCGGGCCCGGGCCCGGGGGGCCC平末端•4、来源：________生物原核限制酶存在于原核生物中的作用是什么?思考原核生物容易受到外源DNA的入侵限制酶的作用:切割外源DNA,使之失效保证自身的安全限制酶为什么不会剪切原核生物本身的DNA?思考•防御机制•1.同一原核细胞内有限制酶,但没切割序列•2.有酶且有切割序列,但甲基化酶的作用下把甲基转移到碱基上,让限制酶不能切割•要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切点？可产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏性末端？要切两个切点，产生四个黏性末端，两个。•如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性末端。•是不是把两者的黏性末端黏合起来，这样就真的合成重组的DNA分子了?实际还不够,还需要DNA连接酶进行连接。思考题：……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……不同来源的DNA片段混合将不同种来源的DNA片段连接起来生物A基因片段生物B基因片段……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……酶切1、作用:把DNA片段拼接成新的DNA，2、作用原理：催化磷酸二酯键形成,（不是氢键）DNA连接酶——“分子缝合针”可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键T4DNA连接酶三、分子缝合针——DNA连接酶连接酶种类来源作用E.coliDNA连接酶T4连接酶大肠杆菌T4噬菌体只能连接黏性末端连接黏性末端、平末端(1)、作用：恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。DNA连接酶和DNA聚合酶异同？•相同点——作用位点都在磷酸二酯键思考不同点：聚合酶：单个与片段之间（单个核苷酸与核苷酸片段）连接酶：片段与片段之间（核苷酸片段与核苷酸片段）DNA聚合酶DNA连接酶DNA连接酶DNA聚合酶：用于DNA的复制以DNA一条链为模板DNA连接酶：用于拼接DNA双链，不需要模板DNA连接酶连接酶将_____DNA片段的两个缺口上同时连接，不需要模板双链______酶、________酶、________酶的作用位点都在_____________键限制DNA连接DNA聚合磷酸二酯4.基因的运输工具——运载体质粒存在于许多细菌和酵母菌等生物中,是细菌拟核DNA之外能够自主复制的很小的双链环状DNA分子。常用的运载体：质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒等。四、分子运输车——基因进入受体细胞的载体1.常用载体:_____________________________质粒,λ噬菌体衍生物,动植物病毒基因工程使用的质粒一定要经过人工改造!(1)能在细胞内进行__________(2)有________切割位点,便于目的基因插入(3)具有______基因,供重组DNA和筛选(4)必须是安全的(5)载体大小适合自我复制限制酶标记拓展2.载体的必备条件:注意标记基因常以抗生素抗性基因作为标记基因例：抗四环素基因，氨苄青霉素抗性基因在对四环素无抗性的大肠杆菌导入抗四环素基因，再置于含四环素的培养基中培养。对四环素无抗性置于四环素中含抗四环素基因置于四环素中不死说明：抗四环素基因能成功表达，细菌具有抗四环素的能力返回课堂基因工程之第2节基本操作程序基因工程主要是通过人工的方法分离，改造，扩增并表达生物的特定基因•那些已被或准备要分离，改造，扩增或表达的特定基因或DNA片段，称为目的基因基因工程的步骤：获取目的基因获取运载体构建运载体导入(受体细胞)基因复制基因表达用同种限制酶核心步骤二步骤三步骤四步骤一步骤一获取目的基因•一.获取目的基因的工具:获取目的基因提取运载体•二.获取目的基因的方法:(1)从基因文库中获取(2)用PCR技术扩增目的基因(3)人工合成法用限制酶人工合成：若基因_____，核苷酸序列又______，则可用此法。较小已知人工合成的目的基因目的基因的mRNA单链DNA(cDNA）双链DNA(即目的基因)反转录合成1）反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列目的基因推测推测化学合成2）根据已知的氨基酸序列利用DNA合成仪合成（一）、人工合成目的基因如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，这时候往往就需要构建基因文库，然后从基因文库中直接获取目的基因。步骤一从基因文库中获取目的基因什么叫基因文库？将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因文库基因组文库部分基因文库（cDNA文库）基因组文库:基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库.部分基因文库:基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.①基因文库的构建方法通过对受体菌的培养而储存基因提取某种生物的全部DNA限制酶一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接重组DNA分子基因组文库导入受体菌②基因组文库的构建有启动子和内含子基因组文库与部分基因文库的关系③cDNA文库的构建-----反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。目的基因的mRNA单链DNA反转录酶DNA聚合酶双链DNA(目的基因)基因组DNA文库cDNA文库基因组DNA文库与cDNA文库的比较真核生物的基因用逆转录法得到的cDNA与原基因相同吗？有哪些差异？原核生物基因呢？思考？编码区非编码区非编码区DNA聚合酶剪接有关的酶RNA聚合酶mRNA前体mRNA单链DNAcDNA逆转录酶转录剪接逆转录复制启动子终止子基因不含非编码系列。即不含非编码区和内含子基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较•构建基因文库后，要鉴定出文库中带有目的基因的克隆，有3种通用鉴定方法•1用标记的DNA探针进行DNA杂交•2用抗体对蛋白质进行免疫杂交•3对蛋白质的活性进行鉴定步骤一目的基因的获取（二）从基因文库中直接获取按照外源DNA片段的来源：从特定组织提取的染色体基因组DNA---基因组DNA文库（总）mRNA反转录成的cDNA拷贝----cDNA文库（部分）②基因文库的目的为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。①基因文库的分类使用基因文库是分离基因，特别是分离高等真核生物基因的有效手段。如果一个哺乳动物的基因组是3×109碱基对，直接从细胞中提取并分离出某一特定基因的DNA片段在技术上是很困难的。但是在基因文库中，只要有该基因的探针存在，采用DNA分子杂交技术即可分离并获取目的基因。（三）PCR技术•原理：•前提：•原料•方式PCR扩增仪DNA复制一段已知目的基因的部分核苷酸序列：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）指数2n模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；2、具体过程比较项目DNA复制PCR技术解旋方式场所酶温度条件合成对象联系区别解旋酶催化高温变性解旋细胞内（主要是细胞核内）细胞外（在PCR扩增仪内）DNA解旋酶、DNA聚合酶等热稳定性DNA聚合酶（Taq酶）细胞内温和条件需控制温度，在较高温度下进行DNA分子DNA片段或基因模板：均需要脱氧核苷酸链作为模板进行物质合成原料：均为四种脱氧核苷酸酶：均需要DNA聚合酶进行催化引物：均需引物，使DNA聚合酶从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸二、基因表达载体的构建——核心质粒DNA分子限制酶处理两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种一个切口两个黏性末端1.过程：资料:科学家在培育抗虫棉时，起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入抗虫基因启动子，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入抗虫基因终止子，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。表达载体构建组成要完