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1.2层析技术1.2.1层析技术的原理和分类1906年俄国植物学家M.Tswett将含有植物叶子色素的溶液，通过装填有白垩粒子吸附剂的柱子后，各种色素被分开。证明植物叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。分开的色素形成不同的色带，因此称为色谱法（Chromatography），又称层析法。到1931年色谱法才用于分离复杂的有机混合物。柱层析很难鉴定微量物质，因此发展了纸层析法（PaperChromatography，简称PC）。在这种“平面”技术中，分离主要是通过滤纸上的分配来实现的。利用平面层析法的优点发展了薄层层析法（Thin-LayerChromatography，TLC）。薄层层析的分离是在涂布于玻璃板或某些坚硬材料上的薄层吸附剂上进行。通过施加电场可提高纸层析或薄层层析对离子化合物的分离效率，这种改进方法被称为纸上电泳或薄层电泳。1941年英国生物学家Martin和Synge提出色谱塔板理论。这是在色谱柱操作参数基础上模拟蒸馏理论，以理论塔板来表示分离效率，定量的描述、评价层析分离过程。根据液－液逆流萃取的原理，发明了液－液分配色谱（Liquid-LiquidpartitionChromatography）。Martin和Synge预言：①流动相可用气体代替液体，与液体相比，物质间的作用力减小了，这对分离更有好处；②使用非常细的颗粒填料并在柱两端施加较大的压差，应能得到最小的理论塔板高（增加理论塔板数），将会提高分离效率。气相色谱仪是1952年Martin和James发展起来的层析法，适用于分离气体混合物或挥发性液体和固体。具有分辩率高、分析迅速和检测灵敏等优点。上世纪60年代末产生了高效液相色谱（High-PerformanceLiquidChromatography，HPLC），适用于快速分离非挥发性或热不稳定样品。色层分析法已不限于分离有色物质，但色谱法或色层分析法的名称仍被沿用。现称为层析法或层析技术。层析法的特点是分离效率高，它能分离各种性质极相类似的物质。既可用于少量物质的分析鉴定，又可用于大量物质的分离纯化制备。层析法作为一种分析分离手段与方法，广泛用于科研与工业生产上。如在石油、化工、医药卫生、生物科学、环境科学、农业科学等领域发挥重要作用。1.2.1.1层析技术原理层析法是利用待分离混合物中各组分物理、化学及生物学特性的差异，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中，由于各组分随流动相前进的速度不同而被分离。例如：利用物质在溶解度、吸附能力、立体化学特性及分子的大小、带电情况及离子交换、亲和力的大小及特异的生物学反应等方面的差异，使其在流动相与固定相之间的分配系数不同，达到彼此分离的目的。分配系数是在一定的条件下，某种组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比值，常用K表示。分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据。K=Cm/CsCm是流动相中的浓度，Cs是固定相中的浓度。分配系数主要与被分离物质的性质、固定相和流动相的性质以及层析柱的温度有关。一般情况下，分配系数与温度成正比。对于K值相近的不同物质，可通过改变温度来增大K值间的差异，达到分离的目的。所有层析系统都由两个相组成：①固定相是层析的一个基质。为固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等）或是固定于固体物质上的成分（如固定在硅胶或纤维素上的溶液）。基质可与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用。对层析效果起关键作用。②流动相是层析过程中推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等。如水和各种溶剂。柱层析中的流动相一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随流动相向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配。与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。以逆流分溶或逆流分配的方法来说明分配层析的原理。取一系列试管（称分溶管)，向第1号管加入互不相溶的两种溶剂，A溶剂为上相，作为流动相、B溶剂为下相，作为静相，并假设上下两相的体积相等。然后加入物质Y（Kd=1）和物质Z（Kd=3）的混合物（假设总量各为64份）。对于层析柱可以假设：①层析柱的内径和柱内的填料是均匀的，而且层析柱由若干层组成。每层高度为H，称为一个理论塔板。塔板一部分为固定相占据，一部分为流动相占据，且各塔板的流动相体积相等，称为板体积（Vm）。②每个塔板内溶质分子在固定相与流动相之间瞬间达到平衡，且忽略分子纵向扩散。③溶质在各塔板上的分配系数为常数，与溶质在塔板的量无关。④流动相通过层析柱可视为脉冲式的不连续过程。从一个塔板到另一个塔板流动相体积为Vm。当流过层析柱的流动相的体积为V时，则流动相在每个塔板上跳越的次数为n。n=V/Vm⑤溶质开始加在层析柱的第0塔板上。假定将连续层析过程分解成间歇的动作，因此它与多次萃取过程相似，一个理论塔板相当于一个两相平衡的小单元。分配系数不同的物质在层析时的迁移率不同。迁移率：在一定条件下，在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值。用Rf来表示。Rf值是衡量各组分的分离情况的数值，Rf值在0～1之间，Rf值相差越大，分离效果越好。层析的效果可用分辨率Rs表示，Rs是相邻两组分（峰）的分开程度。Rs：相邻二组分的色谱峰保留值（洗脱体积）之差与峰宽总和的一半的比值。21211222WWYWWVVRRRSRs值越大两组分分离的越好。当Rs=1时两组分具有较好的分离，互相沾染约2%，即每种组分的纯度约为98%。当Rs=1.5时两组分基本完全分开，每种组分的纯度可达99.8%。若两组分浓度相差较大时，则要求较高的分辨率。影响分辨率的因素是多方面的，应根据实际情况综合考虑，对于生物大分子还需考虑其稳定性和活性等。如pH值、温度等都会产生较大的影响。在一定条件下，某种组分与基质（固定相）反应达到平衡时存在于基质上的饱和容量称为操作容量。操作容量越大，表明基质对该物质的亲合力越强。由于分子大小（空间效应）、带电荷的多少、溶剂的性质等多种因素的影响，同种基质对不同分子的操作容量不同。实际操作时上样量要小一些，特别要控制生物大分子样品的加入量，否则不能有效分离。1.2.1.2层析法的分类①按两相所处的状态分类流动相有3种状态：液体作为流动相的称液相色谱（liquidchromatography）；气体作为流动相的称为气相色谱（gaschromatography）。当流动相是在接近它的临界温度和压力下工作的液体时称超临界色谱。固定相有两种状态：以固体吸附剂作为固定相；以附载在固体上的液体作为固定相。按固定相不同分为：液－固色谱（liquid-solidchromatography）、液－液色谱（liquid-liquidchromatography）、气－固色谱（gas-solidchromatography）、气－液色谱（gas-liquidchromatography）。②按层析原理分类吸附层析（adsorptionchromatography）：以吸附剂为固定相，根据待分离物与吸附剂间的吸附力不同而达到分离的目的。分配层析（partitionchromatography）：在有两相同时存在的溶剂系统中，由于不同物质的分配系数不同从而被分离。离子交换层析：(ion-exchangechromatography)以离子交换剂为固定相，根据物质的带电性质不同而进行分离。体积排阻色谱（即凝胶层析，gelchromatography）：以具有网状结构的凝胶颗粒为固定相，根据物质的分子大小进行分离。亲和层析法：根据生物大分子和配体之间的特异性亲和力（如酶和抑制剂、抗体和抗原、激素和受体等），将某种配体连接在载体上作为固定相，而对能与配体特异性结合的生物大分子进行分离。亲和层析是分离生物大分子最为有效的层析技术，具有很高分辨率。③按固定相附着方式不同分类柱层析（columchromatography）、纸层析（paperchrmatography）、薄层层析（thinlayperchromatography）和薄膜层析法。④根据极性分类反相色谱：流动相极性＞固定相极性，极性大的分子比极性小的分子移动速度快，先从柱中流出。正相色谱：流动相极性＜固定相极性，非极性分子或极性小的分子比极性大的分子移动速度快，先从柱中流出。一般分离纯化极性大的分子（带电离子等）采用正相色谱，分离纯化极性小的有机分子多采用反相色谱。1.2.1.3层析法的特点与应用特点：①层析法与光学、电学或电化学仪器联用，可检测出层析后各组份的浓度或质量；可用于定性及定量测定，同时绘出层析图，②与电子计算机联用可使操作及数据处理自动化，大大缩短分析时间。③分辨率高、灵敏度高、选择性好、速度快。应用：层析法适用于杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生物样品的分离分析。1.2.2层析法实验技术1.2.2.1纸层析1.2.2.2薄层层析1.2.2.3聚酰胺薄膜层析1.2.2.4凝胶层析1.2.2.5离子交换层析1.2.2.6亲和层析1.2.2.7气相色谱1.2.2.8高效液相层析1.2.2.1纸层析纸层析法(paperchromatography)简单、廉价，适宜于分离小分子物质。如氨基酸、核苷酸、有机酸、糖、维生素和抗菌素等。Calvincycle的发现纸层析是最简单的液-液相分配层析。滤纸为支持物，滤纸纤维与水有较强的亲和力，约能吸收20～22%的水，其中部分水与纤维素羟基以氢键形式存在，而滤纸纤维与有机溶剂的亲和力很小，所以滤纸的结合水为固定相，以水饱和的有机溶剂为流动相。当流动相沿滤纸经过样品点时，样品点上的溶质在水和有机相间不断进行分配，由于混合物中各组分的分配系数有差异，移动速度不同而彼此分开。影响纸层析迁移率Rf值的主要因素有：样品的结构和性质、溶剂的性质、PH值、温度和滤纸性质。实验操作过程包括：滤纸的选择、展层剂的选择、样品预处理（除去金属离子等杂质）、点样饱和与展层、显色（化学法或物理法）、Rf值测定、定量（洗脱比色法或斑点面积法）。黄精理化鉴别展开剂：苯酚40g：水10ml：浓氨水5滴。下行展形。显色剂：邻苯二甲酸1.66g：苯胺0.93ml，溶于水饱和的正丁醇100ml。1.2.2.2薄层层析薄层层析(thin-layerchromatography，TLC)是在玻璃板上涂布一层支持剂（吸附剂），将待分离的样品点在薄层板的一端，用流动相展开，将样品分离。支持剂包括：硅胶、氧化铝、活性炭、硅藻土、纤维素粉、交联葡聚糖凝胶等。原理：由于选用的支持剂不同，其原理也不相同，如：分配层析、吸附层析、离子交换层析、凝胶层析等。薄层层析分类层析名称理化性质类型吸附薄层层析吸附力，分配系数吸附分配聚酰胺薄层层析氢键吸附，分配系数吸附分配层析离子交换薄层层析酸碱度，极性离子交换层析凝胶薄层层析分子大小分子排阻层析高效薄层层析吸附分配层析应用：主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备，定性定量。薄层层析操作方便、设备简单、分辨率比纸层析高10~100倍。但是对生物大分子分离效果不佳。例如氨基酸、肽、核苷酸、有机酸、糖脂和激素等的分离和鉴定。通常为一次性使用。可结合薄层扫描仪使用。分离生物碱1.2.2.3聚酰胺薄膜层析原理：聚酰胺与被分离的极性物间形成氢键产生吸附作用，流动相通过聚酰胺膜时由于样品在溶剂和薄膜之间的分配系数不同而使样品分离。聚酰胺分为：尼龙-66和锦纶-6两类。由于含有大量的酰胺基团，统称聚酰胺。它以其-CO-或-NH-与极性化合物的-OH或=O间形成氢键，发生吸附作用。特点：分辨力强、灵敏度高、速度快、样品不扩散、操作方便。特别适合对蛋白质的N-端氨基酸残基分析。1.2.2.4凝胶层析法凝胶层析（gelchroma