植物总DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测

农业生物学实验教学中心植物总DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测制作人：刘红梅植物基因组DNA的提取琼脂糖凝胶电泳检测脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)与蛋白质结合在一起以核蛋白（DNP）的形式存在。在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白释放出来。植物总DNA包括细胞核DNA和细胞核外DNA,前者存在于细胞核内，后者存在于细胞质中有半自主性复制活性的细胞器内，例如线粒体DNA(mtDNA)和叶绿体DNA(ctDNA)。背景知识核酸的存在形式DNA为白色类似石棉样的纤维状物，RNA的纯品呈白色粉末或结晶。核酸和核苷酸大都呈酸味。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水。在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱碱性溶液中较稳定。核酸的理化性质细胞破碎抽提去蛋白质沉淀核酸基本过程①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；②化学试剂法：用SDS处理细胞；③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。细胞破碎SDS法SDS是有效的阴离子去垢剂,细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,SDS能够破坏这种价键。CTAB法CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。DNA提取蛋白质常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊醇（24：1）抽提。RNA常选用RNase消化，或是用LiCl来消除大分子的RNA。酚类物质提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。多糖提取液中加1％PVP。DNA纯化（去杂质）实验材料新鲜蔬菜叶片(去叶脉)试剂2×CTAB抽提液TE缓冲液(pH=8.0)氯仿：异戊醇(24:1)材料与试剂①离心机②水浴锅③研钵④微量移液器仪器用具移液器－量程的选择1．取2g清洗凉干的新鲜叶片于研钵中，加1/3药匙石英砂和4mL2倍的CTAB提取液，迅速研磨。2．将1mL研磨液转入1.5mL离心管中，置于65℃水浴中保温20min，其间颠倒混匀2－3次。破碎细胞3.12000r/min离心5min，取上清液700μL转到另一离心管中。加入等体积氯仿：异戊醇（24:1）混合液，充分颠倒混匀。12000r/min，离心5min。抽提去蛋白4．将上清液移入新的1.5mL离心管内，加600µL异丙醇。颠倒混匀，可见DNA絮状沉淀。沉淀核酸5．12000r/min，离心1min，倒掉上清液，将离心管倒置干燥。将沉淀回溶于20µLTE缓冲液待测。操作步骤1)选取新鲜材料，研磨迅速彻底，研磨好的材料应与CTAB抽提液充分混匀；2)若提取产物有颜色，可能是材料中含有较多的多酚类物质，添加巯基乙醇（2－5％），尽可能选取幼嫩的材料；3）收集CTAB与核酸形成的复合物时不要离心过度，否则沉淀再溶解难；4）为了获得具有生物活性的天然核酸，在分离制备过程中必须采用温和的条件，避免过酸过碱、剧烈地搅拌，防止热变性，同时还要避免核酸降解酶类的降解。注意事项DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定电场强度下，DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数成反比。电泳原理琼脂糖是一种线性多糖聚合物。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的分离范围(Kb)(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2仪器和试剂仪器–电泳仪–电泳槽–灌胶模具等–Tris-硼酸（TBE）Tris-乙酸（TAE）Tris-磷酸（TPE）常用电泳缓冲液电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。作用：①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。③使样品呈色，使加样操作更方便。上样缓冲液溴化乙锭（EB）是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般5ng。核酸染色剂注意事项：EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。–DNA分子量标准不同种类DNAMarker1.凝胶制备制备0.8%琼脂糖凝胶。称取适量琼脂糖加入20mL0.5×TBE，加热至琼脂糖全部熔化，冷却至50-60℃时，加入EB至终浓度0.5µg/mL。缓慢倒入胶板，待胶凝固后拔出梳子。2.加样取10µlDNA样液与2µl上样buffeer混匀，用微量移液器小心加入样品槽。3.电泳接通电源，切记靠近加样孔的一端为负，电压为1~5V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）,待溴酚兰移动到一定位置，停止电泳。4.观察拍照四、操作步骤紫外仪上观察电泳带及其位置。绘制核酸电泳示意图。作业1.结合原理，简述CTAB法分离提取植物总DNA的基本过程。2.为了获得高质量的植物总DNA，在分离提取过程中应注意那些问题？思考