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第一章血液标本采集与处理临床免疫学检验技术第十二章免疫组织化学技术欧启水目录第一节酶免疫组织化学技术第二节荧光免疫组织化学技术第三节亲和组织化学技术第四节免疫标记电镜技术第五节免疫组织化学技术的临床应用第六节影响免疫组织化学技术的主要因素免疫组织化学技术（immunohistochemistrytechnique）又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。根据标记物的不同，免疫组织化学技术可分为：酶免疫组织化学技术荧光免疫组织化学技术免疫金（银）组织化学技术亲和组织化学技术免疫标记电镜组织化学技术免疫组织化学的基本过程包括：抗原的提取与纯化免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化将标记物与抗体结合形成标记抗体标本的处理与制备抗原抗体免疫学反应以及标记物呈色反应观察结果第一节酶免疫组织化学技术定义：在一定条件下，应用酶标抗体（抗原）与组织或细胞标本中的抗原（抗体）发生反应，催化底物产生显色反应，通过显微镜观察标本中抗原（抗体)的分布位置和性质，也可通过图像分析技术达到定量的目的。标本类型：有组织切片、组织印片和细胞涂片等。酶免疫组化技术可分为酶标记抗体免疫组化技术和非标记抗体酶免疫组化技术两种类型。直接法：将酶直接标记在特异性抗体上，与组织细胞内相应的抗原进行特异性反应，形成抗原-抗体-酶复合物，最后用酶底物显色。间接法：将酶标记在第二抗体上，先将第一抗体（特异性抗体）与相应的组织抗原结合，形成抗原抗体复合物，再用第二抗体（酶标记的抗体）与复合物中的特异性抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色。酶标记抗体免疫组织化学染色直接法间接法优点操作简便特异性强检测敏感性高制备一种酶标二抗可用于检测多种抗原或抗体缺点敏感性低制备的抗体种类有限特异性不如直接法操作较为繁琐酶标记抗体免疫组织化学染色比较酶桥法：抗酶抗体作为第三抗体，通过桥抗体（第二抗体），将特异性识别组织抗原的第一抗体与第三抗体连接起来，形成酶联的抗原-抗体复合物，加底物显色（图12-1）。非标记抗体酶免疫组织化学染色酶桥法图12-1酶免疫组织化学（酶桥法）原理示意图过氧化物酶抗过氧化物酶（PAP）法：是在酶桥法基础上加以改良。PAP法首先将酶桥法的第三抗体（抗酶抗体）与酶组成可溶性复合物（PAP复合物，图12-2）。该复合物由2个抗酶抗体和3个过氧化物酶分子组成，呈五角形结构，非常稳定。通过桥抗体（第二抗体），将特异性识别组织抗原的第一抗体与PAP复合物的抗酶抗体连接起来，此时要求特异性第一抗体与第三抗体的动物种属相同（图12-3）。非标记抗体酶免疫组织化学染色PAP法图12-2PAP复合物图12-3酶免疫组织化学（PAP法）原理示意图双桥PAP法：该法建立在PAP法的基础上。其基本原理是在PAP法中通过两次连接桥抗体和PAP复合物而建立起来的，通过双桥可结合更多的PAP复合物于抗原分子上，以增强敏感性。碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶（APAAP）法：用碱性磷酸酶代替HRP建立的碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,AP)—抗碱性磷酸酶(AAP)法，即简称APAAP。其技术要点与PAP法相似。非标记抗体酶免疫组织化学染色酶免疫组织化学染色中的常用酶及显色底物：酶底物颜色辣根过氧化物酶（HRP）二氨基联苯胺（DAB）棕色氨基乙基卡巴唑（AEC）橘红色4-氯-1-萘酚灰蓝色碱性磷酸酶（AP）α-萘酚磷酸盐+快蓝深蓝色α-萘酚磷酸盐+快红红色溴氯羟吲哚磷酸盐（BCIP）+氮蓝四唑（NBT）紫蓝色第二节荧光免疫组织化学技术采用荧光素标记的已知抗体（或抗原）作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原（或抗体），形成的抗原抗体复合物上带有荧光素，在荧光显微镜下，可以分辨出抗原（或抗体）所在位置及性质，并可利用荧光定量技术计算其含量，以实现抗原（或抗体）定位、定性和定量测定的目的。定义标本类型：涂片和印片组织切片：冷冻切片；石蜡切片细胞培养标本活细胞染色标本的保存：标本在固定干燥后，最好立即进行荧光抗体染色及镜检。如必须保存时，则应保持干燥，置4℃以下保存。但病毒和某些组织抗原标本抗原性丧失很快，数天后就失去其抗原性，需在-20℃以下保存。组织处理常用于荧光免疫组织化学技术的荧光素包括异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate,FITC）、藻红蛋白（phycoerythrin,PE）等。荧光抗体的标记及纯化详见第四章。根据染色方法的不同，荧光免疫组织化学技术可区分为直接法和间接法。荧光抗体染色的结果一般用“-”或“+”表示。染色及结果判读详见第八章。荧光抗体的标记及染色第三节亲和组织化学技术一些具有双价或多价结合力的物质如植物凝集素(lectin)、生物素（biotin）和葡萄球菌A蛋白（staphylococcalprotein，SPA）等，对某种组织成分具有高亲和力的特点，可以与标记物如荧光素、酶、同位素、铁蛋白及胶体金等结合，采用荧光显微镜、酶加底物的显色反应、放射自显影或电子显微镜，在细胞或亚细胞水平进行对应亲和物质的定位、定性或定量分析。定义生物素-亲合素法葡萄球菌蛋白A法凝集素法链霉亲合素-生物素法亲和组织化学技术亲合素-生物素-过氧化酶复合物技术(avidin-biotin-peroxidasecomplextechnique，ABC)：按一定比例将亲合素与酶标生物素结合．形成可溶性亲合素-生物素－过氧化物酶复合物（ABC）。当其与检测反应体系中的生物素化抗体（直接法，图12-4）或生物素化第二抗体（间接法）相遇时，ABC中末饱和的亲合素结合部位即可与抗体上的生物素结合，使抗原抗体反应体系与ABC标记体系连成一体进行检测。生物素-亲合素法ABC直接法图12-4亲和组织化学（ABC直接法）原理示意图桥联亲合素-生物素技术(bridgedavidin-biotintechnique，BRAB)：该技术不同于ABC法，是以游离的亲合素作为桥联剂，利用亲合素的多价性，将检测反应体系中抗原、生物素化抗体复合物与标记生物素（如酶标生物素）联结起来，达到检测反应分子的目的。生物素-亲合素法标记生物素-抗生物素技术(labelledavidin-biotintechnique，LAB)：以标记亲合素直接与免疫复合物中的生物素化抗体连接进行检测。该法具有相当高的灵敏度，由于省略了加标记生物素步骤，操作较BRAB法简便。间接LAB法采用的是生物素化的第二抗体，可以进一步提高检测灵敏度。生物素-亲合素法根据SPA能与多种动物IgG的Fc段结合的原理，用SPA标记物（酶、荧光素、放射性物质等）显示抗原与抗体结合反应的免疫检测实验。SPA具有和人及多种动物如豚鼠、兔、猪、犬、小鼠、猴等IgG结合的能力，可解决不同动物样本检测时，需分别标记相对应的二抗的问题。SPA结合部位是Fc段，这种结合不会影响抗体的活性。葡萄球菌蛋白A法凝集素（lectin）可采用直接法和间接法进行细胞化学染色。直接法：将标记物直接结合在凝集素上，使其与组织细胞相应的糖蛋白或糖脂相结合。间接法：先将凝集素与组织细胞膜糖基结合，然后再用标记的抗凝集素抗体（即用凝集素免疫动物制备抗凝集素抗体）与结合在细胞上的凝集素反应。凝集素法链霉亲合素(streptavidin，SA)是从链霉菌培养物提取的一种纯蛋白，不含糖基，有4个生物素结合位点，并且具有高度的亲和力，其功能类似亲和素。利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉亲和素蛋白就构成了酶标链霉亲合素-生物素方法(labelledstreptavidinbiotintechnique，LSAB)。链霉亲合素-生物素法第四节免疫标记电镜技术利用高电子密度的颗粒性标记物（如胶体金、铁蛋白等）标记抗体，或用经免疫组织/细胞化学反应能产生高电子密度产物者如HRP标记抗体，在电子显微镜下对抗原抗体反应中的高电子密度标记的抗原（抗体）进行亚细胞水平定位的技术。相较于其他免疫组织化学技术是在光镜下进行抗原定位，免疫标记电镜技术在电子显微镜下的定位更为精确，可定位至细胞膜、细胞器，在探索病因、发病机制、组织发生等方面有其独特的优点。原理在组织固定与取材时选用固定剂不宜过强，在取材方面，免疫电镜技术较光镜免疫化学技术要求更迅速、更精细。在免疫染色方面，又分为包埋前染色、包埋后染色和超薄切片染色三种。免疫标记电镜技术标本制备要求免疫胶体金染色法免疫胶体铁细胞化学染色法酶免疫电镜技术常用的免疫标记电镜技术第五节免疫组织化学技术的临床应用荧光免疫组织化学技术的应用：1.在自身免疫性疾病中的应用2.细菌和病毒的快速鉴定3.寄生虫的检测与研究酶免疫组织化学技术的应用：1.提高病理诊断准确性2.癌基因蛋白的临床应用3.对肿瘤细胞增生程度的评价4.发现微小转移灶5.在肿瘤分期上的意义6.指导肿瘤的治疗免疫组织化学技术的临床应用（一）荧光激活细胞分类仪（FACS）（二）共聚焦显微镜技术（三）免疫组织化学—显微切割技术免疫组织化学技术的拓展第六节影响免疫组织化学技术的主要因素标本的处理标本的主要来源各种体液及穿刺液活体组织培养细胞标本固定的目的：使细胞内蛋白质凝固，细胞内分解酶反应终止，以防止细胞自溶，保持细胞形态和结构。保存组织细胞抗原性。防止标本脱落。除去妨碍抗体结合的类脂，便于保存。抑制组织中细菌的繁殖，防止组织腐败和在后续组织制备中的细胞结构和成分的改变。标本的固定与保存固定剂的选择:蛋白质类抗原，可用乙醇或甲醇固定。微生物抗原可用丙酮或三氯化碳固定。如需除去病毒的蛋白质外壳，可使用胰蛋白酶。多糖类抗原用10%福尔马林固定或以微火加热固定。如有粘液物质存在，应用透明质酸酶等处理除去。类脂质丰富的组织进行蛋白、多糖抗原检测时，需用有机溶剂（乙醚、丙酮等）处理除去类脂。标本的固定与保存制片方法的评价：冰冻和石蜡切片是免疫组化最常用的制片方法。为了使抗原达到最大限度的保存，首选的制片方法是冰冻切片。其操作简便，可避免石蜡切片因固定、脱水、浸蜡等对抗原所造成的损失，适用于不稳定的抗原。石蜡切片是研究形态学的主要制片方法，它不但是观察组织细胞结构的理想方法，而且可用在陈旧石蜡包埋材料免疫组化的回顾性研究。切片薄而有连续性，可长期保存，但对抗原的保存不如冰冻切片。标本的固定与保存抗原的保存与修复酶消化法常用的抗原暴露、修复方法盐酸水解法微波法高压锅法煮沸法抗体的选择：应注意选择具有高度特异和稳定的抗体，根据需要决定采用单克隆或多克隆抗体。抗体的稀释：抗原抗体反应要求有合适的比例，过量或不足均不能达到预期结果。抗体的保存：在保存抗体时，要特别注意保持抗体的生物活性，防止抗体蛋白质变性。抗体的处理与保存对照的设立：阳性对照。阴性对照。其他：空白、替代、吸收或阻断试验均为确证试验。阳性结果：阳性细胞的显色可位于细胞质、细胞核和细胞膜表面。免疫组织化学的呈色深浅可反映抗原存在的数量，可作为定性、定位和定量的依据。阳性细胞可呈散在、灶性和弥漫性分布。免疫组化的结果判断阴性结果及抗原不表达：阴性结果不能简单地认为具有否定意义，因为阳性表达有强弱、多少之分，哪怕只有少数细胞阳性（只要是在抗原所在部位）也应视为阳性表达。特异性和非特异性显色的鉴别：根据分布位置和显色强度等进行鉴别。免疫组化结果与HE切片结果：当免疫组化检查结果与HE切片诊断不一致时，应综合分析，不能简单地用免疫组化结果推翻HE切片诊断。免疫组化的结果判断试剂质量控制：抗体的质量；合适的稀释度、稀释剂、孵育温度和孵育时间等。操作过程质量控制：包括实验操作和标本的质量控制。技术设备、仪器和器具的质量控制：需定期对相关设备、仪器（含基本实验液体）和器具进行校准。操作相关工具如吸管、试管、加样枪等需进行消毒。质量控制重点提示免疫组织化学技术的定义、种类及基本过程。免疫荧光组织化学技术中标本的类型及保存。直接法和间接法酶标记抗体免疫组织化学染色的基本原理。荧光免疫组织化学技术和酶免疫组织化学技术的应用。免疫