真核细胞RNA的提取及电泳分析

真核细胞RNA的提取及电泳分析中南大学生命科学学院实验目的掌握一种真核细胞RNA的提取方法熟悉RNA的琼脂糖凝胶电泳检测分析实验原理rRNA,80～85%tRNA,10～15%，约5S/70-120ntmRNA,1～5%，长短不一28S，4700nt18S，1900nt5.8S，160nt5S，120nt哺乳动物细胞总RNA:真核细胞RNA分布于胞质75%、胞核10%、细胞器15%实验原理Trizol试剂是由苯酚和异硫氰酸胍等组成的单相、快速抽提总RNA的试剂。十二烷基肌氨酸钠：破细胞膜及核膜，释放RNA、DNA和蛋白。异硫氰酸胍：RNase抑制剂，抑制内源性RNase。苯酚：使蛋白变性。实验原理当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，离心后形成水相层和有机相层。RNA位于水相，而DNA和蛋白质位于分界层和有机相。水相中RNA在高盐和有机溶剂共存时沉淀分离。提取的RNA可用于Northern杂交、mRNA分离、cDNA合成、RT-PCR。实验试剂RNAisoBlood氯仿异丙醇75%乙醇（DEPC处理水配制）RNase-free水微量移液器台式微量离心机电泳槽凝胶成像系统主要仪器电泳仪实验步骤1.取0.25ml血液样品移至离心管中，添加0.75mlRNAisoBlood。2.用移液枪上下反复吸打直至细胞完全裂解。3.加入0.2ml氯仿，混匀至溶液呈乳白色。4.室温静置5分钟。5.12,000×g、4℃离心15分钟。6.吸取上清液移至新的离心管中（切勿吸出白色中间层）。7.向上清中加入等量体积的异丙醇，上下颠倒混匀后，室温下静置10分钟。8.12,000×g、4℃离心10分钟，试管底部会出现RNA沉淀。9.弃上清,加入等量的75％乙醇，振荡清洗沉淀后，7,500×g、4℃离心5分钟，弃上清。10.室温干燥沉淀2~3分钟，加入30µlRNase-free水溶解沉淀。11.取5µl电泳检测，剩余-70℃保存。注意事项RNase（核糖核酸内切酶）生物特性十分稳定，耐热、耐酸、耐碱，作用不需辅助因子，存在十分广泛，本实验的关键是创造一个无RNase的环境，减少RNA的降解。注意事项去除外源性RNase的污染，包括操作者、工作环境、试剂及耗材等环节戴口罩和手套，少少说话；工作台面洁净，可用3%H2O2擦洗，空气中无灰尘；离心管、Tip等塑料品用0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液浸泡12h，后高温高压灭菌处理；玻璃或陶瓷制品可180~250℃干烤8~4h;RNA溶解水溶液用DEPC处理过，后高温高压灭菌使用（DEPC分解成CO2和H2O）抑制内源性RNase的活性细胞裂解后RNase随之释放，应及时加入其抑制剂，如异硫氰酸胍。注意事项RNase活性抑制：物理法（高温），化学法（DEPC、VRC【氧钒核糖核苷复合物】、H2O2），生物法（RNasin）。不同组织样品的预处理（如组织块、贴壁细胞）每105~107细胞可提取50~100ugRNA。样品体积不要超过裂解液的10%。样品保存：样品用Trizol打散后于-70℃可保存一个月以上。分离的RNA最好尽快反转录成cDNA等，保存在75%乙醇中于2~8℃一周，-20℃一年。结果分析电泳后应该是有3条主带，尤其是28S和18S两条带锐利清晰且亮度比约2:1，无DNA杂带及向前拖尾现象（无降解）。纯品RNA和DNA的OD260/OD280（R）应为2.0和1.8，所以提取RNA的R值应保证在1.8~2.0，R1.8表示有蛋白、DNA或有机溶剂污染，R2.2表示有降解。Tris水溶解RNA应保证2.0R2.2。-70℃和-20℃保存无明显差异，否则为内源性RNase污染。问题及解决方法抽提产量较低1.样品裂解不完全－减少样品、延长裂解时间或加大提取液；2.RNA未完全溶解，会带来OD比值过低－延长溶解时间且RNA不可过分干燥；3.实验材料质量不佳－新鲜样品或生长旺盛细胞；4.离心不够充分－加大转速及延长时间。问题及解决方法RNA有降解1.样品不新鲜或提取过程时间有延误－组织样边研磨边加入液氮；2.RNA存放不够低温－-70℃；3.提取液加入不足，内源RNase没被充分抑制－减少样品或加大提取液；4.外源RNase没被充分抑制－所用试剂与耗材要有防止RNase处理。问题及解决方法有DNA污染1.样品裂解不完全，会带入蛋白污染；2.取上清时取道中间层，会带入蛋白污染；3.加入氯仿震荡过于剧烈。谢谢！