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课题2月季的花药培养植物花药离体培养的意义花粉粒（1N）单倍体植株（1N）二倍体纯合子植株（2N）缩短了育种周期，为新品种的培育开辟了新途径。花的结构二、基础知识（一）被子植物的花粉发育花粉：花丝花药雄蕊囊状结构，内有很多花粉粒雄蕊花粉囊当花粉囊的壁组织逐步发育分化时，会形成大量的花粉母细胞（小孢子母细胞）。花粉花粉粒是由花粉母细胞经过减数分裂而形成，因此，花粉粒是单倍体的生殖细胞。被子植物花粉的发育要经历：四分体时期、单核期和双核期等阶段。基础知识一、被子植物的花粉发育阅读课本P37～P38花粉发育过程减数分裂有丝分裂小孢子母细胞花粉母细胞小孢子减数分裂有丝分裂花粉管细胞核生殖细胞核有分丝裂精子1个营养细胞生殖细胞4个4个4个4个4个8个（小孢子四分体时期单核居中期单核靠边期双核期）小孢子母细胞（2n）小孢子四分体时期（n）单核居中期（n）双核期4个生殖细胞核（n）4个花粉管细胞核（n）4个生殖细胞（n）4个营养细胞（n）4×2个精子(n)有丝分裂减数分裂单核靠边期（n）有丝分裂卵细胞的形成大孢子母细胞减数分裂4个大孢子（3个退化消失）3次核分裂1个卵细胞5个其它细胞2个极核成熟胚囊的结构与功能极核2:与一精子结合,发育成胚乳卵细胞1:雌配子,受精后发育成胚.雄蕊（花药）（花粉粒）花柱头花柱雌蕊（精子2个）卵细胞（1个）1个精子受精卵胚胚珠极核（2个）1个精子受精极核胚乳种子子房珠被种皮果实子房壁果皮根、茎、叶精子2个（生殖细胞核）花粉管细胞核（营养细胞核）胚状体花药中的花粉花药中的花粉胚状体愈伤组织丛芽丛芽生根移栽脱分化分化再分化诱导愈伤组织丛芽说明：两种途径之间并没有绝对的界限，主要取决于培养基中激素的种类及其浓度配比。（二）产生花粉植株的两种途径人工种子（三）影响花药培养的因素1、材料的选择：⑴不同种类植物的诱导成功率不同。⑵同一种植物，亲本植株的生理状况对诱导成功率有直接影响。⑶合适的花粉发育时期：花期早期时的花药比后期更容易产生花粉植株。一般月季的花药培养选择五月初到五月中旬，即月季的初花期。⑷选择最合适的花粉发育时期——是提高诱导成功率的重要因素•原因：不是任何时期的花粉都可以经过培养产生愈伤组织或胚状体，在花粉发育的过程中只有一个时期对离体刺激敏感。一般来说细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养成功率最高。①不选择单核期之前花药原因：花药质地幼嫩，容易破碎；②不选择单核期之后花药原因：花瓣开始松动，给材料消毒带来困难；③挑选单核期花药方法：应当选择完全未开放的花蕾，菌少，易消毒。2、培养基的组成花药培养所采用的培养基各成分中植物生长调节剂的水平和配比起决定作用。⑴诱导愈伤组织或胚状体产生的培养基：广泛使用2，4-D、IAA和KT；⑵诱导分化的培养基常除去2，4-D而以IBA或BA等代之。3、其他因素：•材料的低温预处理（延缓小孢子衰老）、接种密度、培养的环境条件等对诱导的成功率都有一定的影响。三、实验操作（一）材料的选取（二）材料的消毒（三）接种和培养1.选择花药一般通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期。2.最常用的方法：某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用焙花青—铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色。三、实验操作（一）材料的选取醋酸洋红法、焙花青—铬矾法。鉴定花粉：①最常用的方法是醋酸洋红法：花药（载玻片上）→1%的醋酸洋红1滴→用镊柄将花药捣碎，盖上盖玻片→镜检（花粉粒的细胞核被染成红色）②某些植物的花粉细胞核不易着色，需要采用焙花青—铬钒法：花药（在卡诺氏固定液中处理20min）→取出，置于载玻片上→焙花青－铬钒溶液染色→盖上盖玻片→镜检（花粉粒的细胞核被染成蓝黑色）•注：花粉细胞核内有染色体，染色体主要由DNA和蛋白质组成，醋酸洋红为碱性染色剂，染色体容易被染色。通过染色，可以确定细胞核为单核期还是双核期，是单核居中期还是单核靠边期。一般单核靠边期的花药培养成功率最高。1、花蕾用体积分数为70%的酒精浸泡30秒2、无菌水清洗3、无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分4、放入质量分数为0.1%的氯化汞溶液中2～4分钟（也可质量分数为1%的次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液）5、无菌水冲洗3～5次用于培养花药，实际上多数未熟，由于它的外面有花萼、花瓣或颖片保护，通常处于无菌状态，所以只要将整个花蕾或幼穗消毒即可。•（二）材料的消毒灭菌后花蕾，要在无菌条件下除去萼片和花瓣，并立即将花药接种到培养基上。在剥离花药时，要尽量不损伤花药（否则接种后，容易从受伤部位产生二倍体的愈伤组织），同时还要彻底去除花丝，因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成。（三）接种和培养经过20-30天培养后，会发现花药开裂，长出愈伤组织或释放出胚状体。将愈伤组织及时转移到分化培养基上，以便进一步分化出再生植株。每瓶接种花药7-10个，温度控制在25℃左右，不需要光照。幼小植株形成后才需要光照。如果花药开裂释放出胚状体，则一个花药内就会产生大量幼小植株，必须在花药开裂后尽快将幼小植株分开，分别移植到新的培养基上，否则这些植株将很难分开。对培养出来的植株做进一步的鉴定和筛选。因为在花药培养中，特别是通过愈伤组织形成的花粉植株，常常会出现染色体倍性的变化。四、结果分析与评价1、选材是否恰当选材是否成功是花药培养成功的关键。应学会通过显微镜观察处于适宜发育期的花粉。2、无菌技术是否过关如果出现了污染现象，说明某些操作步骤，如培养基灭菌、花蕾消毒或接种等有问题。3、接种是否成功如果接种的花药长出愈伤组织或释放出胚状体，花药培养的第一步就成功了。要适时转换培养基，以便愈伤组织或胚状体进一步分化成再生植株。植物组织培养技术与花药培养技术的异同点项目相同点不同点植物组织培养技术离体的植物组织经脱分化形成愈伤组织，再分化成丛芽，诱导出根，然后进行移栽。外植体为体细胞，染色体数无需加倍。花药培养技术取材为花药，培养的为单倍体幼苗，植株弱小，高度不育，必须用秋水仙素处理，使染色体加倍，恢复正常植株的染色体数，而且为纯种。植物组织培养与花药离体培养的比较比较项目植物组织培养花药离体培养理论依据基本过程影响因素选择材料培养结果细胞的全能性脱分化、再分化材料、营养、激素、PH、温度、光照体细胞花药（花粉）正常植株单倍体植株花药离体培养与花粉离体培养的异同•一、从概念来看，花药离体培养是把花粉发育到一定阶段的花药接种到培养基上，来改变花药内花粉粒的发育程序，使其分裂形成细胞团，进而分化成胚状体，形成愈伤组织，由愈伤组织再分化成植株。花粉离体培养是指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术，由于花粉已是单倍体细胞，诱发它经愈伤组织或胚状体发育而成的植株都是单倍体，且不受花药的药隔、药壁、花丝等体细胞的干扰。二、从培养层次来看，花药离体培养属器官培养，花粉离体培养属细胞培养，但花药离体培养和花粉离体培养的目的一样，都是要诱导花粉细胞发育成单倍体细胞，最后发育成单倍体植株。三、从培养过程来看，花药离体培养相对较容易，技术比较成熟，但最后需要对培养成的植株进行染色体倍数检测；花粉离体培养尽管不受花药壁、药隔等二倍体细胞的干扰，但这种特殊单倍体细胞的培养技术难度较大，目前只在少数植物上获得成功。实例一•关于被子植物花粉发育的说法，不正确的是（）•A、花粉粒是在花药中的花粉囊里形成的•B、被子植物精子的形成是直接减数分裂的结果•C、被子植物的花粉的发育要经历四分体时期、单核期、双核期等阶段•D、花粉粒在发育过程中，核先位于细胞一侧，再移到细胞中央注：花粉母细胞经减数分裂形成4个单核花粉粒，每个花粉粒的细胞核进行一次有丝分裂形成1个花粉管细胞核和1个生殖细胞核，每个生殖细胞核再进行一次有丝分裂生成2个精子。BD课后习题：•1、F2代紫色甜玉米的基因型组成可能为Aasusu或Aasusu。如果运用常规育种方法，将F2代中的紫色甜玉米与白色甜玉米（aasusu）进行测交，可以选择出基因型为AAsusu纯种紫色甜玉米。但这种方法比较繁琐，耗时较长，需要至少三年的选种和育种时间。如果利用花药离体培养的技术，在F1代产生的花粉中就可能有Asu的配子组合，再将花粉植株进行秋水仙素处理，使染色体加倍，就可以直接得到紫色甜玉米的纯合体（AAsusu）。这种方法可以大大缩短育种周期。•2、植物组织培养技术与花药培养技术的相同之处是：培养基配制方法、无菌技术及接种操作等基本相同。两者不同之处在于：花药培养的选材非常重要，需事先摸索时期适宜的花蕾，花药裂开后释放出的愈伤组织或胚状体也要及时更换培养基，对培养基配方的要求更为严格。这些都使花药培养的难度大为增加。比较杂交育种、诱变育种、多倍体育种、单倍体育种项目杂交育种诱变育种多倍体育种单倍体育种处理杂交用射线、化学药品处理用秋水仙素处理种子或幼苗花药离体培养原理基因重组，把两亲本优良性状组合在同一后代中用人工方法诱发基因突变，产生新性状和新品种抑制细胞分裂中纺锤体的形成，使染色体数加倍后不形成两个细胞诱导配子直接发育成植株，再用秋水仙素加倍成纯合体优缺点方法简便，但耗时长，需经多年才能获得纯合体加速育种进程，大幅度改变某些性状，但有利个体不多器官较大，营养物质含量高，但发育延迟，结实率低缩短育种年限，但方法复杂，成活率低举例水稻杂交高产量青霉素菌株三倍体无子西瓜、八倍体小黑麦月季花药培养人工种子人工种子是指通过植物组织培养技术获得具有胚芽、胚根、胚轴等结构的植物胚状体，并且用适当方法将胚状体包裹起来，用以代替天然种子进行繁殖的一种结构。目前研制的人工种子，是由胚状体、作为保护性外壳的人工种皮和提供发育所需营养的人工胚乳三部分组成的。能在一定的条件下萌发生长，形成完整植株。人工种子的优点:首先，它解决了有些作物品种繁殖能力差、结子困难或发芽率低等问题。第二，人工种子可以工业化生产，提高农业的自动化程度。第三，人工胚乳中除含有胚状体发育所需的营养物质外，还可以添加各种附加成分，如固氮细菌、防病虫农药、除草剂和植物激素类似物等，有利于幼苗茁壮成长，提高作物产量。第四，用人工种子播种可以节约粮食。例如，一个12L的发酵罐在20d内生产的胡萝卜胚状体，可以制成1000万粒人工种子，满足几千公顷农田的种植需要，与天然种子相比，大大节约了粮食。练习：小麦高杆（D）对矮杆（d）为显性，抗锈病（T）对不抗锈病（t）为显性，现有高杆抗锈病和矮杆不抗病的两种纯合体，要获得矮杆抗锈病的良种，可用杂交育种和单倍体育种法，步骤如下：高杆抗锈病矮秆不抗锈病PDDTT×ddtt↓(一)F1的基因型表现型a各种配子的种类a↓（二）符合要求的单倍体的基因型良种的基因型表现型↓（三）（1）请在上图横线上填写上基因型、表现型内容。（2）图中（一）（二）（三）采用的处理方法分别是、、。（3）单倍体育种方法的主要优点是。答案：（1）DdTt，高秆抗锈病，DT，Dt,dT,dt,ddTT矮秆锈病（2）杂交育种、花药离体培养，秋水仙素处理（3）可以明显缩短育种年限，加速育种进程。