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基因工程及其应用第2节惠东高级中学能发荧光的热带斑马鱼普通热带斑马鱼是不发荧光的你知道为什么能把人的基因“嫁接”到细菌上吗？你能推测出，这种基因的“嫁接”是怎么实现的吗？你能举出一些类似的、与你的生活关系很密切的例子吗？“嫁接”了人胰岛素基因的工程菌一、基因工程的概念：又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。原理操作环境操作对象操作水平基本过程结果基因重组生物体外基因/DNA分子水平剪切→拼接→导入→表达人类需要的基因产物1、基因的“剪刀”——限制性核酸内切酶专一性：识别特定核苷酸序列，在特定的切点切DNA，具特异性。并裂解磷酸二酯键，产生两个黏性末端。二、基因操作的工具黏性末端例：大肠杆菌的一种限制酶(EcoRⅠ)能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。EcoRⅠ被同一种限制酶切断的几个DNA是否具有相同的黏性末端？思考:2、基因的“针线”——DNA连接酶连接酶的作用：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。连接的部位：生成磷酸二酯键DNA连接酶的作用过程：连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。基因的针线：DNA连接酶GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCG用同种限制酶切割3、基因的运输工具——运载体常用的运载体：质粒、噬菌体和动植物病毒等标记基因，便于进行检测。质粒存在于许多细菌和酵母菌等生物中,是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子.作为运载体必须具备哪些条件？1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。2）具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。3）具有某些标记基因，便于进行筛选。如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。1、细胞染色体（或拟核DNA分子）外能自主复制的小型环状DNA分子；2、质粒的存在对宿主细胞无影响；3、质粒的复制只能在宿主细胞内完成。质粒可作为有何特点？三、基因工程的操作步骤从细胞中分离出DNA从大肠杆菌中提取质粒限制酶提取目的基因限制酶目的基因与运载体结合DNA连接酶目的基因导入受体细胞目的基因的表达与检测基因工程操作的基本步骤•四个基本步骤：1）提取目的基因2）目的基因与运载体结合3）将目的基因导入受体细胞4）目的基因的检测和表达三、基因工程的操作步骤•目的基因的提取方法直接分离基因人工合成基因反转录法根据已知的氨基酸序列合成DNA：鸟枪法二、基因工程的操作步骤用限制酶切断成许多片段⑴直接分离基因——鸟枪法将供体细胞中的DNA用限制酶切割为许多片段，再用运载体将这些片段都运载到不同的受体细胞中去，让这些DNA片段在受体细胞中扩增。从中找出含有目的基因细胞，并将含有目的基因的DNA片段分离出来。该法最大的缺点是带有很大的盲目性，工作量大。一般不适用于真核细胞的基因。⑵人工合成基因法DNA合成仪②直接合成法：根据蛋白质的氨基酸顺序推算出信使RNA核苷酸顺序，再据此推算出基因DNA的脱氧核苷酸顺序。用游离脱氧核苷酸直接合成相应的基因。①反转录法：以信使RNA为模板，在逆转录酶的作用下将脱氧核苷酸合成合成DNA(基因)。用与提取目的基因相同的限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后，在连拉酶的作用下连接形成重组DNA分子。•目的基因与运载体结合三、基因工程的操作步骤目的基因与运载体结合的结果可能有三种情况：目的基因与目的基因结合，质粒与质粒结合，目的基因与质粒结合。所以需要筛选。作用：将外源基因送入受体细胞•常用的受体细胞：•步骤三：目的基因导入受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。主要借鉴细菌或病毒侵然细胞的途径导入方式：三、基因工程的操作步骤1）将细菌用CaCl2处理，以增大细菌细胞壁的通透性。2）使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。3）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。三、基因工程的操作步骤导入过程：运载体为质粒，受体细胞为细菌大量的受体细胞接受不多的目的基因。处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。无表达产物无表达产物有表达产物无表达产物三、基因工程的操作步骤•步骤四：目的基因的检测和表达检测：通过检测标记基因的有无，来判断目的基因是否导入。表达：通过特定性状的产生与否来确定目的基因是否表达。•受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？•步骤四：目的基因的检测和表达三、基因工程的操作步骤二、基因工程的操作步骤水母转基因抗虫棉花转入苏云金杆菌的一个抗虫基因，是中国目前最主要的转基因作物1、基因工程与作物育种转黄瓜抗青枯病基因的甜椒转鱼抗寒基因的番茄转黄瓜抗青枯病基因的马铃薯不会引起过敏的转基因大豆运用基因工程技术，不但可以培养优质、高产、抗性好的农作物及畜、禽新品种，还可以培养出具有特殊用途的动、植物。乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷)生长快、耐不良环境、肉质好的转基因鱼(中国)导入贮藏蛋白基因的超级羊和超级小鼠导入人基因具特殊用途的猪和小鼠超级动物特殊动物我国生产的部分基因工程疫苗和药物⑴基因工程药品的生产许多药品的生产是从生物组织中提取的。受材料来源限制产量有限，其价格往往十分昂贵。微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。若将生物合成相应药物成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。2、基因工程在医学上的应用胰岛素从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素！使其价格降低了30%-50%!通过基因工程的方式创造了能合成人干扰素的大肠杆菌，每1Kg的培养液可提取20—4０mg干扰素。•干扰素治疗病毒感染简直是“万能灵药”！过去从人血中提取，300L血才提取1mg！其“珍贵”程度自不用多说。基因工程人干扰素α-2b（安达芬），是我国第一个全国产业化基因工程。安达芬具有抗病毒，抑制肿瘤细胞增生，调节人体免疫功能的作用，广泛用于病毒性疾病治疗和多种肿瘤的治疗，是当前国际公认的病毒性疾病治疗的首选药物和肿瘤生物治疗的主要药物。其它基因工程药物人造血液、白细胞介素、乙肝疫苗等通过基因工程实现工业化生产，均为解除人类的病苦，提高人类的健康水平发挥了重大的作用。人造血液及其生产⑵基因诊断与基因治疗诊断：用放射性同位素等标记的“DNA探针”检测肝炎病毒等病毒感染及遗传缺陷，不但准确而且迅速。我国研究人员正在制备用于基因治疗的基因工程细胞治疗：把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的。基因诊断——DNA探针概念：是用已知序列的DNA或RNA片段作为探针与待测样品的DNA或RNA序列进行核酸分子杂交，用于对待测核酸样品中特定基因顺序的探测，是基因诊断最基本的技术之一。条件：（1）必须是单链；（2）带有容易被检测出来的标记物。原理：DNA分子杂交（碱基互补配对）基因诊断——生物芯片从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱；从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病变的DNA信息。基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。基因治疗——用正常的基因取代或修补病人细胞中有缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的1990年9月14日，安德森对一例患ADA缺乏症的4岁女孩进行基因治疗。这个4岁女孩由于遗传基因有缺陷，自身不能生产ADA，先天性免疫功能不全，只能生活在无菌的隔离帐里。他们将这个女孩的白血球进行基因改造，使有缺陷的基因被健康的基因替代，然后把含正常白血球的溶液输入她左臂的一条静脉血管中。在以后的10个月内她又接受了7次这样的治疗，同时也接受酶治疗。后来，她的免疫功能日趋健全，能够走出隔离帐，过上了正常人的生活，并进入普通小学上学。取患者骨髓分离干细胞病毒正常基因导入正常基因的干细胞注入患者体内⑴环境监测：基因工程做成的DNA探针能够十分灵敏地检测环境中的病毒、细菌等污染。1t水中只有10个病毒也能被DNA探针检测出来3、基因工程与环境保护利用基因工程培育的“指示生物”能十分灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污染而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物。⑵环境污染治理：基因工程做成的“超级细菌”能吞食和分解多种污染环境的物质。通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因工程培育成功的“超级细菌”却能分解石油中的多种烃类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解DDT等毒害物质。阅读课本Ｐ１０５讨论：转基因食品安全吗？五、转基因生物和转基因食品的安全性转基因植物的安全性争论•支持派认为：如果转基因农业生物技术得不到社会支持，这一研究将被扼杀，并且强调，迄今为止并没有发现转基因食品危害人体健康和环境的确切证据。•美国人食用转基因食品已多年，超级市场上有4000多种商品是含有转基因植物成分的，还没有事例证明人吃了以后会得病，甚至会引起死亡。加拿大、澳大利亚也是转基因食品的生产大国，均有几千万人在吃，到现在为止也没有—个案例说明它有问题。反对派的观点•一英国科学家声称，转基因马铃薯会减弱老鼠免疫系统功能；•美国康乃尔大学也发现，转基因玉米会危害蝴蝶幼虫及其相关生态环境。•环保团体认为这种违反自然的转基因作物及产品，未经长期安全测试，长期食用可能对人类及生态环境造成负面影响。•尤其是注重环境和生态保护的欧盟国家，对转基因作物更加排斥，因而抵制美国GMO产品的进口。“转基因食品，要不要贴标签?”•若转基因产品与目前市售的产品具有实质等同性，则不需再加特殊的标签；•若转基因产品中含有对一部分人群有过敏性反应的蛋白，则需加标签，以使购买者作出选择。我国•2001年6月6日，国务院公布的《农业转基因生物安全管理条例》规定，不得销售未标识的农业转基因生物，其标识应注明产品中含有转基因成分的主要原料名称；有特殊销售范围的还应注明并在指定范围内销售。几种常见育种方法的比较育种方法杂交育种单倍体育种多倍体育种诱变育种基因工程育种基本原理方法优点缺点实例作业：杂交→自交→选优基因重组不同个体的优良性状可集中到同一个个体上育种时间长，需及时发现优良性状杂交水稻中国荷斯坦牛花药离体培养、秋水仙素诱导加倍染色体变异明显缩短育种年限，后代一般都为纯种技术复杂，成本高普通小麦花药离体培养秋水仙素处理萌发的种子、幼苗染色体变异植物茎杆粗壮，果实、种子大，营养高发育延迟，结实率低无籽西瓜物理或化学方法处理动植物、微生物基因突变提高变异频率，大幅度改良某些性状，加速育种进程有利变异少，需要处理大量实验材料，具有不确定性青霉菌高产菌株的培育黑农五号大豆基因重组将一种生物特定基因转移到另一种生物体内染色体变异定向地改造生物的遗传性状可能引起生态危机，技术难度大转基因抗虫棉DNA的一段序列EcoRI识别序列ECORI切割位点目的基因用相同的限制性内切酶切割