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专题2微生物的培养与应用微生物的概念与分类概念：个体多数十分微小，结构都相当简单，通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到的低等生物。特点小（个体微小）简（结构简单）低（进化地位低）微生物的类群原生生物：原核生物:真菌:病毒:如酵母菌、霉菌单细胞的动植物如草履虫、单细胞藻类等微生物包含了除植物界和动物界以外的所有生物无细胞结构真核细胞细菌、蓝藻等原核细胞课题1微生物的实验室培养防止杂菌入侵，获得纯净的培养物，是研究和应用微生物的前提。一方面需要为培养的微生物提供合适的营养和环境条件，另一方面需要确保其他微生物无法混入。一、基础知识：（一）培养基（二）无菌技术（一）培养基人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。按物理状态分2.类型1.概念：液体培养基固体培养基（加入凝固剂琼脂）固体培养基液体培养基一般用于增菌（扩大培养）、工业生产一般用于分离纯化、鉴定、计数菌落由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体按功能状态分选择培养基鉴别培养基基础培养基种类用途例选择培养基鉴别培养基从众多微生物中分离所需的微生物鉴别不同种类的微生物加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌伊红—美篮培养基使大肠杆菌的菌落呈深紫色，可以鉴别大肠杆菌几种选择培养基：加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基:分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基:分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基:分离自养型微生物3.营养成分：不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、和氮源、无机盐等营养物质。讨论：为什么大多数培养基都含有这四类物质？（1）基本成分：碳源无机碳源：有机碳源：CO2、CO32-、HCO3-牛肉膏、蛋白胨等自养微生物异养微生物氮源无机氮源：有机氮源：NH4＋、NO3-牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等1000mL牛肉膏蛋白胨固体培养基配方培养基组分提供的主要营养牛肉膏5.0g碳源、氮源、磷酸盐和维生素蛋白胨10.0g氮源和维生素NaCl5.0g无机盐H2O定容至1000ml氢元素、氧元素（2）特殊营养：细菌生长必需，而往往自身不能合成的化合物，如维生素、某些氨基酸、碱基等（3）pH、氧气等要求1.无菌技术的概念无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。（1）对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。（2）将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。（3）为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。（4）实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。定义方法2.消毒与灭菌较为温和理化方法，杀死部分有害菌体（不包括芽孢、孢子）强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）煮沸消毒法巴氏消毒法化学药剂紫外线消毒灭菌灼烧灭菌干热灭菌高压蒸汽灭菌煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min化学药剂消毒法:用70%酒精进行皮肤消毒;氯气消毒水源紫外线消毒消毒的方法：干热灭菌：160-170℃下加热1-2h。高压蒸气灭菌：100kPa、121℃下维持15-30min.灼烧灭菌灭菌的方法：1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。2、请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手灭菌高压蒸气灭菌灭菌高压蒸气灭菌/干热灭菌消毒微生物实验室培养的基本操作程序1、器具的灭菌2、培养基的配制3、培养基的灭菌4、倒平板5、微生物接种6、恒温箱中培养7、菌种的保存二、实验操作准备工作（一）制备牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌）1．计算2．称量3．溶化4．调pH5．灭菌6．倒平板配制步骤：倒平板技术倒平板技术1.将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拨出棉塞。1234倒平板技术2.右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰。1234倒平板技术12343.用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基(约10~20mL)倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。倒平板技术12344.等待平板冷却凝固，大约需5~10min。然后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。（二）纯化大肠杆菌接种方法有：平板划线法稀释涂布平板法平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。微生物的接种技术1、平板划线法一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。平板划线的操作方法问题讨论1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？答：第一步灼烧是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？问题讨论答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？问题讨论答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。2、稀释涂布平板法将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养。稀释涂布平板法梯度稀释菌液分别（依次）涂布平板1.将分别盛有9mL水的6支试管灭菌，并按101~106的顺序编号。梯度稀释菌液注意：移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管离火焰1~2cm处.涂布平板涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。问题讨论微生物的恒温培养微生物的恒温培养微生物的恒温培养菌种的保存1.临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4℃冰箱保存。2.长期保存：甘油冷冻管藏法四、课题成果评价（一）培养基的制作是否合格如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。（二）接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。（三）是否进行了及时细致的观察与记录培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同本课题知识小结:微生物在生命活动过程中，需要不断地从外界吸收营养物质，通过新陈代谢，获取能量并合成自身的组成物质，以维持正常的生长和繁殖。培养基