分解纤维素的微生物的分离

纤维素：棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物；纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过70亿吨；分布植物的根、茎、叶中；1、在草食性动物等的消化道内，也共生有分解纤维素的微生物，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素，而人没有分解纤维素的能力。2、农作物秸秆：米秸、麦秸、稻草、草、木屑等富含大量的纤维素，被利用的机会很少、效率低；纤维素生物燃料：最有希望替代石油能源科学家正致力于研究，怎样将农业废弃物、木材及生长更为迅速的草本植物，转化为种类繁多的生物燃料（甚至是航空燃油）。课题3分解纤维素的微生物的分离（一）纤维素与纤维素酶纤维素：一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，广泛地存在于植物的根、茎、叶等器官中。纤维素酶：由微生物分泌的一种复合酶，包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，由于它们的协同作用，最终将纤维素分解成葡萄糖。纤维素C1酶Cx酶纤维二糖葡萄糖苷酶葡萄糖①取二支20mL的试管实验：纤维素酶分解纤维素的实验②各加入一张滤纸条③各加入10mL0.1mol/L的醋酸－醋酸钠缓冲液甲乙④在甲试管中加入1mL蒸馏水，乙试管加入1mL纤维素酶⑤将试管放在140r/min的摇床上振荡1h⑥结果：乙试管的滤纸条消失讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？刚果红染色法刚果红能与像纤维素的多糖形成红色复合物，而不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生该反应。（二）纤维素分解菌的筛选用加入刚果红的纤维素培养基去培养微生物时，如果培养基中出现以菌落为中心的透明圈时，可说明该菌落是纤维素分解菌，因为它已将被刚果红染成红色的纤维素分解了。一、实验设计请你根据实验流程图和提供的三个资料以及“操作提示”，在思考有关问题的基础上，设计出一个详细的实验方案。土壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布在鉴别纤维素分解菌的培养基上筛选产生透明圈的菌落*①取样环境1、土壤取样：富含纤维素的环境（树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等）操作步骤②讨论:如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋在土壤中多深？将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约10cm左右的土壤中。2、选择培养增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。①目的：②制备选择培养基③操作：P29培养基成分分析培养基组成提供主要的营养物质纤维素粉5g碳源（能源）NaNO31g氮源、无机盐KCl0.5gNa2HPO4·7H2O1.2gKH2PO40.9gMgSO4·7H2O0.5g无机盐酵母膏0.5g生长因子、碳源、氮源水解酵素0.5g氮素、生长因子溶解后，蒸馏水定容至1000mL水提示：自变量为培养基的种类，即完全培养基和选择培养基。可用完全培养基做对照,或将纤维素改为葡萄糖。A、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）B、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能分解纤维素的微生物可以大量繁殖。C、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用说明：分析“纤维素分解菌的选择培养基配方”可知，该配方中的酵母膏也能够提供少量的碳源，因此其他微生物也能在该培养基中生长繁殖。但因酵母膏的含量极少，因此，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。在选择培养的条件下，可以使那些能够适应该营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。为什么选择培养能够“浓缩”所需微生物？按照课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释101～107倍。3.梯度稀释1011021031041051064.将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上（1）制备鉴别培养基P29（2）涂布平板：将稀释度为104～106的菌悬液各取0.1ml涂布到平板培养基上，30℃倒置培养。培养基组成提供的主要营养物质CMC-Na5~10g碳源酵母膏1g碳源、氮源、生长因子KH2PO40.25g无机盐土豆汁100mL碳源、生长因子琼脂15g凝固剂上述物质溶解后，加蒸馏水定容至1000mL氢元素、氧元素鉴别纤维素分解菌的培养基(水溶性羧甲基纤维素钠)方法一：先，再加入刚果红进行颜色反应。方法二：在时就加入刚果红。培养微生物倒平板5.刚果红染色法挑选产生透明圈的菌落即为分解纤维素的菌落。这两种方法各有哪些优点与不足？染色法优点缺点方法一方法二有透明圈的基本是能分解纤维素的微生物操作繁琐刚果红会使菌落之间发生混杂操作简便不存在菌落混杂问题1.产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈2.有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。方法一中NaCl溶液的作用？思考：漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。用这方法可以判断酶活力的大小，实际上刚果红是结合到培养基的多糖底物，但分解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能分解这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能结合上去了，氯化钠溶液就可以使结合不牢的刚果红洗去，这样就留下大大小小的透明圈，大的透明圈当然分解纤维素的能力就强！土壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布到鉴别培养基挑选菌落什么样的环境取样?①培养的目的?②选择培养基的特点?挑选什么样的菌落?①鉴别培养基特点?②如何鉴别?根据：微生物对生存环境的要求，到相应环境中去找；增加纤维素分解菌浓度，确保能够从样品中分离到纤维素分解菌；液体培养基是固体培养基刚果红染色法实验回顾挑选有透明圈的菌落在产生明显的透明圈的菌落，挑取并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在300C－370C培养，可获得纯化培养。纯化培养四、结果分析与评价1.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。2.分离的结果是否一致由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行_____________实验，纤维素酶的发酵方法有______发酵和______发酵。纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的________含量进行定量测定。发酵产纤维素酶液体固体葡萄糖五、课题延伸思考：本实验课题2中的实验流程有哪些异同？课题2将土样梯度稀释液直接涂布在以尿素为唯一氮源的选择培养基上，分离并统计菌落。本课题先选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再稀释涂布在鉴别培养基上，挑选菌落。土壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布到鉴别培养基挑选菌落什么样的环境取样?①培养的目的?②选择培养基的特点?挑选什么样的菌落?①鉴别培养基的特点?②如何鉴别?根据：微生物对生存环境的要求，到相应环境中去找；目的：增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物；刚果红染色法分解纤维素的微生物的分离纤维素酶种类、作用、催化活力刚果红染色筛选原理实验设计土壤取样选择培养涂布培养纯化培养前置染色法后置染色法富含纤维素土壤增大分解菌含量染色鉴别分离出分解菌课堂总结DNA重组技术下列不属于微生物的是()A．蓝藻和蘑菇B．葫芦藓和铁线蕨C．噬菌体和黄曲霉D．放线菌和变形虫【解析】病毒、原核生物(例如细菌、放线菌、支原体、蓝藻)、真核类的藻类和真菌及原生动物都是微生物。而一般多细胞的植物与动物不属于微生物，如葫芦藓是苔藓植物，铁线蕨是蕨类植物，都属于多细胞高等植物。【答案】B微生物营养物质有关微生物营养物质的叙述中，正确的是（）A．是碳源的物质不可能同时是氮源B．凡碳源都提供能量C．除水以外的无机物只提供无机盐D．无机氮源也能提供能量【解析】不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况具体分析。对于A、B选项，它的表述是不完整的。有的碳源只能是碳源，如CO2；有的碳源可同时是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，还是能源，如蛋白胨。对于C选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如CO2可作自养型微生物的碳源；NaHCO3可作自养型微生物的碳源和无机盐；而NaCl则只能提供无机盐。对于D选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。【答案】D微生物与病毒的关系关于病毒增殖的叙述中，正确的是（）A．病毒侵入宿主细胞后，合成一种蛋白质B．病毒的繁殖只在宿主的活细胞中进行C．病毒的繁殖以核衣壳为单位D．在普通的培养基上能培养病毒【解析】解答此题需从以下几方面入手分析：首先，病毒是营寄生方式生活，必须生活在活的细胞内，不能独立生活，所以在普通的培养基上不能生活。第二，繁殖时，病毒的核酸进入宿主细胞，利用宿主的成分合成子代个体，除了核衣壳，还应包括该病毒的其他结构。合成的蛋白质不只是一种，应该是多种，包括多种结构蛋白质及物质合成时所需的多种酶。【答案】B培养基的种类要从多种细菌中分离某种细菌，培养基要用（）A．加入青霉素的培养基B．加入高浓度食盐的培养基C．固体培养基D．液体培养基【解析】微生物的分离需使用固体培养基，由于某种细菌的种类不明，所以难以使用选择培养基，如加入青霉素的培养基可以分离到酵母菌和霉菌，加入高浓度食盐的培养基可以分离到金黄色葡萄球菌。【答案】C微生物的计数产生标准菌落的细菌的最初数目和培养基分别是（）A．一个细菌，液体培养基B．许多细菌，液体培养基C．一个细菌，固体培养基D．许多细菌，固体培养基【解析】菌落是一个或几个细菌的子细胞群体，在固体培养基上，有一定的形态结构，肉眼可见，菌落可作为菌种鉴别的重要依据，而多种细菌形成的菌落，就不可能有比较标准的形态。【答案】C