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光镜与电镜技术上海海洋大学水产与生命学院周平凡15692165315第一部分：光学显微镜第二部分：电子显微镜光镜与电镜技术教材电子显微镜技术与应用实用生物医学电子显微镜技术参考书：植物显微技术一、教学第一部分光学显微镜技术与电子显微镜理论第二部分透射电镜原理、结构与操作第三部分扫描电镜原理、结构与操作第四部分电镜样品制备与超薄切片技术二、实验光学显微镜成象系统调整与使用光学显微镜制样与拍摄扫描电镜样品的脱水与干燥、粘样与镀膜(演示)透射电镜照明系统与成像系统合轴等(演示)扫描电镜灯丝饱和点、曝光曲线调节等(演示)透射电镜消像散与拍摄(演示)扫描电镜消象散与拍摄(演示)载网支持膜制备、玻璃刀制作与超薄切片机使用(演示)显微镜的发展一、光学显微镜显微镜理论、制作和应用的发展——从十五世纪开始逐渐发展起来的。1674年荷兰人用自制的显微镜为人类打开了微观世界的大门。一、光学显微镜显微镜的历史1590年荷兰的眼镜匠詹森父子发明了世界上第一台光学显微镜1660年罗伯特·胡克改良了复合显微镜，第一次发现了植物的细胞结构1685年荷兰商人列文虎克在显微镜中加了一块透镜，使得放大倍率达到了200多倍，借助这台显微镜，他观察到了细菌、浮游生物等，成为了第一个发现微生物的人显微镜的发明使人类更深刻地揭示了自然界的奥秘，推动了各学科的发展，反过来由于科学的发展，又促进了显微镜技术的改进，使之日趋完善。显微镜设计与制造现代多为光、机、电的三结合体。一、光学显微镜显微镜根据照明光源的性质可为两大类：光学显微镜——利用人眼可见光(包括不可见的紫外光线)作为光源的而谓之。根据结构、附件、原理、性能以及应用范围的不同又可分为多种类型。光学显微镜的分辨率约为0.2-0.4毫微米，最高放大率为1500倍左右。一、光学显微镜非光学显微镜——利用电子束作为光源，根据“轴对称的电磁场对电子束起着透镜作用这一理论制成所谓的“电磁透镜”，即为电子显微镜。电子显微镜的分辨率约为几个埃，放大率可达几百万倍左右。一、光学显微镜显微镜的种类繁多，根据应用范围可分三大类：生物显微镜——应用范围最广，种类最多，是一类极为重要的研究工具。金相显微镜工业检测显微镜归纳光学显微镜的分类有：1、单式显微镜：各种放大镜、平台解剖镜2、复式显微镜：普通型——（小型教学用），特种型——（中型研究用），高级型——（大型联机多用途研究）一、光学显微镜根据结构和功能可分为普通型：供一般常规镜捡、教学和研究用，如通常的复式显微镜。特种型：利用不同的光学原理设计而制作的显微镜，而且是供某种专门观察和研究之用。如暗场、相衬、偏光、微分干涉、萤光、体视、倒置、比较、金相、显微摄影、电视显示、电影摄影显微镜等。高级型：万能显微镜，指大型多用途、附件较齐全、物镜及目镜等光学部件均高级的显微镜。特种型及高级型:性能较高，而且应用于不同的研究目的，以达到特定的研究效果。又称为“研究用显微镜”。一、光学显微镜正置显微镜倒置显微镜双目显微镜正置显微镜倒置显微镜体视显微镜倒置显微镜组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞。注意：倒置显微镜明场观察时注意把玻片倒置，即盖玻片朝下一、光学显微镜一、光学显微镜一、光学显微镜一、光学显微镜一、光学显微镜一、光学显微镜一、光学显微镜一、光学显微镜一、光学显微镜一、光学显微镜一、光学显微镜一、高级显微镜IX71研究级倒置荧光显微镜适用标本：在各种容器中培养的活细胞标本制片后的各类标本观察方式：明场、相差、荧光BX51正置荧光显微镜适用标本：制片后的各类染色标本观察方式：明场SZX7、SZX16体视显微镜适用标本：各种实体标本各种观察方式1.明场观察BF2.暗场观察DF3.相差观察PH4.偏光观察PO5.微分干涉观察DIC6.浮雕相衬观察RC7.荧光观察FL8.体视观察明场相差微分干涉暗场荧光多用途光镜转盘H：明视野D：暗视野Ph1、Ph2、Ph3：相差DIC：微分干涉显微镜的各种观察方式(一)明场观察方式常规观察方式应用领域：常规镜检、病理、染色标本优点：视野亮度高、均匀，应用范围广，操作简单，价格低，物镜适用于荧光观察缺点：透明标本对比度低，标本没有立体感明场观察应用于病理切片以及染色切片高分辨率，高清晰度，把细节部分清晰的展现出来(一)明场观察方式光强的调节和色温：1.LBD日光平衡滤色片2.通过调节电压来调节光强，色温变化3.通过ND灰度片减弱光强，色温不变孔径光阑的调节载玻片和盖玻片的厚度载玻片1mm盖玻片0.17mm注意：倒置显微镜明场观察时注意把玻片倒置，即盖玻片朝下相差观察观察无色透明标本（观察效果为平面）高反差，高分辨率，可观察到标本细微结构微分干涉可观察无色透明标本，与相差不同，可观察出标本的立体结构，以及标本的外周形态有高对比度，一般，以及高分辨率三种微分干涉可供选择暗场观察利用光的斜射原理可观察一些细小颗粒荧光观察OLYMPUS是唯一一家对近红外进行校正新型照明光源是光效提高一倍从UV到IR的宽波段色差校正六孔激发块转盘多波段辅助滤色镜方型光阑满足特殊需要（可选件）UIS2光学系统平行光路设计，可以自由添加光学附件高性能光学元件独特的离子沉淀镀膜技术人性化外形设计，环保材料明场BFBrightnessFieldmicroscope显微镜的几个基本概念一、光学显微镜显微镜的作用——是一种处理波的工具，是处理可见光及近可见光波段的波，使之成束地照射在被检物体上。其成象落在人眼的视网膜、感光片或其它记录系统(如电视显示或电影)上，突破了人类生理的限制。把视觉伸展到人眼不能分辨的微观世界中去。用来观察、记录和研究经过制片技术处理后的被检物体的细微结构。对微观世界的探索及理论上的研究起着极其重要的作用。广泛地应用于各学科的领域中。一、光学显微镜人眼的重要性——人眼具有敏捷的性能，视觉传入大脑的信息约占各种信息的80％，其高度的准确性、灵敏度、分辨力和适应性等方面，至今在理论上尚未完全解释清楚。人眼的局限性——不能看清很远或太小的物体。对所观察到的物体的形状、大小和远近，不能作出精确的定量比较和计量。对发生在瞬间的现象或事物不能留下长久的记录。只能感受光谱中很窄的可见光（波长约为400-700毫微米）范围内的电磁波。一、光学显微镜显微镜的组成一、光学显微镜一、光学显微镜一、光学显微镜光学显微镜的组成均由单个和多个透镜组成，即由物镜、目镜及聚光镜等部件。透镜是组成显微镜光学系统的最基本的光学原件。透镜依其外形的不同可分为两大类1、凸透镜（又称会聚透镜、正透镜）2、凹透镜（又称散发透镜、负透镜）一、光学显微镜透镜成象凸透镜——在物方所成的象是光线真正的交点，称为“实象”。实象——在屏幕上能显现出来，而虚象则不能，但当我们用眼睛对着透镜观察时，则完全能看到它。凹透镜所形成的象是与物体处在同一方，称为“虚象”。虚象——当一束平行于光轴的光线通过凹透镜后，形成散射光，在象方空间不能相交于一点，只有它们的延长线才能在物方空间相交于一点，这个点称“虚焦点”，这个平面称“虚焦点平面”。一、光学显微镜显微镜的成象原理一、光学显微镜显微镜的成象原理当物体位于透镜物方二倍焦距以内，焦点以外时，则在象方二倍焦距以外形成放大的倒立实象；当物体位于透镜物方焦点以内时，则像方也无象的形成，而在透镜物方的同侧比物体远的位置形成放大的直立虚象。一、光学显微镜显微镜成象原理图一、光学显微镜。透镜的成象质量透镜所形成的象除了象的位置、大小、倒正、虚实之外还有成象的质量问题，也就是说，物体通过透镜后所成的象与理想象上的差异。所产生的象差将直接影响显微镜成象的清晰度和象的变形。透镜所形成的象，应满足几何相似的要求点的象应为一点直线的象应为一直线平面的象应为一平面一、光学显微镜光具有的物理性质折射和折射率光线在均匀的各向同性介质中，二点之间应以直线传播，当通过不同密度介质的透明物体时，则会发生折射现象，这是由于光在不同介质中的传播速度不同所造成的。不同介质的折射率空气——1.0水——1.33甘油——1.405一、光学显微镜“象差”的概念一、光学显微镜影响透镜成象质量的因素从一点发出的光束在通过透镜后，光束的同心性或多或少地受到破坏（由光具有的物理性质及使用的光源的特点以及光具的制作技术而造成），在象空间并不相交于一点，而是分布在一个很小的区域内，所形成的象与理想象在形状、颜色上有着一定的差异，这种差异称为“象差”（Aberration）。一、光学显微镜六种象差的变形情况：1、色差2、球差3、像散4、慧形差5、场曲6、畸变一、光学显微镜无色差有色差1、色差一、光学显微镜2、球差一、光学显微镜3、像散一、光学显微镜4、慧形象差一、光学显微镜5、场曲一、光学显微镜6、畸变一、光学显微镜色差的校正采用单色光作为光源，如采用绿色光；但不能避免球差。利用凸、凹透镜两者所产生的色差型彼此相反，同时采用色散力不同而折射率相同的两种玻璃，分别作成凸凹透镜，将其胶合起来以消除色差。消色差物镜——用光学树脂胶合起来做成透镜组校正色差的产生。复消色差物镜——用各种品种的玻璃以及茧石作成透镜组，可将三种光素(红、绿、蓝)会聚在一点，这样便有效地降低了各焦点和剩余颜色的色差。一、光学显微镜显微镜各项光学的技术参数一、光学显微镜显微镜各项光学技术参数数值孔径、分辨率、放大率、焦深、视场宽度、复盖差、工作距离、图像亮度、视场亮度等。合理使用参数各项参数并不都是越高越好，在使用时，应根据镜检的目的和实际情况来协调各参数之间的关系，以保证分辨率为准。一、光学显微镜数值孔径（NA）又称“镜口率”、“开口率”，简写NA或A。是物镜和聚光镜的主要技术参数，是判断其性能高低的重要标志。数值的大小分别标刻在物镜和聚光镜的外壳上。物镜数值孔径（NA）是前透镜与被检物体之间介质的折射率（η）和孔径角（μ）半数的正弦之积。用公式表示为NA＝ηSin（μ/2）。物镜的数值孔径（NA）一般在0.85-1.4之间。一、光学显微镜聚光镜数值孔径（NA）一般在0.05-1.4范围内变化，它可通过调节孔径光阑的大小来改变NA值的大小，从而达到与物镜NA值相匹配。有的聚光镜可以把上透镜推出光路，NA值则下降。聚光镜的正确使用在观察时，聚光镜的NA值应等于或略大于物镜的NA值；在显微照相时，则应小于物镜的NA值。一、光学显微镜分辨率又称“鉴别率”、“解象力”和“分辨本领”.是衡量显微镜性能的又一个重要技术参数。分辨本领：德国著名理论光学家Abbe早在100多年前就给出分辨本领：δ=0.61λ/nSinα式中，n为物体所处媒介的折射率；α为孔径角；λ为发射光波长。一、光学显微镜人眼的分辨本领在照明良好的情况下，能分辨约0.1mm距离的两物体点。显微镜的分辨本领最小分辨距离也有一定限度，理论计算为物镜能分辨约0.2μm距离的两物体点。一、光学显微镜有效放大率把由显微镜的分辨本领所能分辨开的两点间的距离，放大成相当于人眼能分辨的距离。人眼的分辨本领大致为0.1mm,所以分辨本领为0.2μm的显微镜，其有效放大率是0.1×1000/0.2=500倍。显微镜观察物体时，把物体的像放大到超过肉眼已能详细辨认细节的程度是没有必要的。一、光学显微镜放大率的概念放大率即为放大倍数,是指被捡物镜经物体放大再经目镜放大后，人眼所看到的最终图象的大小对原物体大小的比值。是物镜和目镜放大倍数的乘积。是指长度的放大，而不是指面积的放大。物镜和目镜的放大倍数均标刻在其外壳上。总放大率(M)＝物镜放大率(Mob)x目镜放大率(Moc)一、光学显微镜物镜与目镜的合理使用观察时应在有效放大率的范围内来选择。使用100X