麝香保心丸：治疗性血管新生和系统生物学研究(新)

1麝香保心丸：治疗性血管新生和系统生物学研究TherapeuticAngiogenesisandtheSystemsBiologicResearchofSXBXPill2冠心病的治疗，要解决血氧供需平衡，不是减少心肌耗氧，就是增加冠脉供血血管新生背景与概念血管新生的研究方法促进治疗性血管新生的方法麝香保心丸促血管新生研究提要3治疗性血管新生研究背景Folkman在1970年代早期发现血管新生：肿瘤生长:血管生长因子与血管新生相关1983年,Kumar等发现：心肌梗塞后有“血管生长因子”1980年代中期，确定并纯化了多种与血管新生有关的多肽1994年JeffIsner’s实验室倡导将血管生成用于心血管研究中。EllisUnger’s实验室发现应用促血管生成的蛋白质可以改善冠脉侧支。JudahFolkman（1933-2008）美国国家科学院院士，于70年代提出了肿瘤新生血管学说，该理论后被心血管领域应用于促血管新生研究4侧支血管形成的种类微血管生长（Angiogenesis）血管发生（Vasculogenesis）动脉生成（Arteriogenesis）三者的机理是不同的5血管新生(angiogenesis)相当于废墟上重建在缺血区域现有血管基础上通过芽生(sprouting)、分枝方式形成成熟的血管，由初级网状血管结构到复杂网状血管结构的过程。血管内皮细胞基底膜降解、细胞外基质消化吸收。内皮细胞向血管生长刺激物方向移行和增殖。移行的血管内皮细胞伸展，彼此相连形成血管芽孢。血管内皮细胞增殖使中空的管腔延长。6血管发生（Vasculogenesis）相当于原材料新建血管增生——来源于中胚层前体的内皮细胞原位分化、增殖形成初级毛细血管丛。血管重构——初级毛细血管形成互相连接、分支众多、成熟的血管结构。7动脉生成（Arteriogenesis）相当于休闲动脉的动员原有的侧支血管——正常心脏冠脉间存在的交通吻合血管，直径20至200μm,呈薄壁样管状结构，通常状态下呈关闭状态。开放不仅仅是一个被动过程，开放后会出现一系列细胞生长因子分泌、DNA合成和细胞增殖等血管主动生长过程。8治疗性血管新生（TherapeuticAngiogenesis）手术搭桥（冠脉旁路血管移植术）药物搭桥（药物促进的治疗性血管新生）通过药物、基因治疗或其他手段促进冠状动脉的血管新生，以达到改善心肌缺血症状和患者预后的目的。9治疗性血管新生的意义生长因子：FGF,VEGF血管新生细胞活化侧枝循环建立心肌缺血冠脉狭窄冠脉病变•减轻或防止心肌缺血坏死•预防和延缓缺室壁瘤形成•改善临床症状和预后增加供需失衡中的供给量10血管新生的研究方法和进展11筛选模型—鸡胚绒毛尿囊膜实验鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验目前血管新生药物初步研究主要采用CAM模型。CAM作为一项研究体内血管效应的技术，实验材料易得、操作简便、实验周期短、结果易于观察，尤其适用于大批量血管效应药物的初步筛选。12动物急性心肌缺血模型兔、鼠选择性冠状动脉结扎、栓塞造成动物缺血模型，给予干预后观察梗死周边区血管新生情况。大鼠心梗模型的制备13慢性心肌缺血模型3周后左冠造影狭窄明显、前向血流缓慢14血管内皮细胞培养血管内皮细胞培养：因为人脐静脉(HUV)在某些方面具有与动脉生物学特征相似的优点，较之动物血管内皮更符合人体情况。增殖：MTT比色法迁移：Transwell小室体外成血管：体外血管生成试剂盒分泌：培养液内NO、VEGF人脐静脉内皮细胞培养15血管生长因子/抑制因子干预因素对组织生长因子/抑制因子的影响生长因子：VEGF、bFGF，TGF、促血管生成素-1（Ang-1）抑制因子：血管新生抑制素、内皮细胞抑制素、组织金属蛋白酶抑制剂、血栓反应素-1，2(thrombospodin-1&2，TSP-1&2)、血小板因子-4(PF-4)等缺血心肌中的VEGF染色颗粒16促进治疗性血管新生的方法促血管生长因子的应用干细胞移植药物干预17外源性输注生长因子目前，研究最广泛的血管生成生长因子家族为VEGF和FGF。给急性心肌梗死动物冠脉内注射bFGF，心肌梗死的面积显著缩小，缺血或梗塞心肌内毛细血管及小动脉数目增加。VEGF是一种内皮细胞特异性有丝分裂原和活体血管新生诱导物。VEGF因其对内皮细胞作用的特异性而广泛应用于实验性肢体及心肌缺血的研究。18导入生长因子基因近来病毒介导的基因转染已作为一种血管形成生长因子释放的方法应用于慢性缺血动物模型。VEGF基因，PDGF基因将含VEGFcDNA的真核表达载体pVS121吸附在球囊上，并定位转移至梗塞冠状动脉近心端。转染VEGF基因后心肌血管密度明显增加，有效促进了血管新生。19临床试验结果：并不理想首次：冠脉内和静脉内灌注VEGF165蛋白，在60天的运动耐量、心肌灌注、心绞痛症状或功能分级等方面，治疗组并未获得显著性益处。FGF血管重建临床试验(FIRST)：一次冠脉内灌注FGF-2，患者功能状况和症状分级显著改善，但90天后运动耐量和心肌灌注与安慰剂相比没有差异VEGF、FGF的一系列双盲、随机的临床研究并没有成功的提出绝对清晰的治疗效果证据，与获临床承认仍有很大的差距。20骨髓干／祖细胞移植成人EPC和造血干细胞发生于共同的干细胞，都来源于造血器官骨髓。有希望促进血管新生并改善心功能，为缺血性心脏病提供了一种新的治疗选择。用PCR法对人工血管内侧再内皮化细胞的基因进行分析，证实移植的骨髓细胞能参与内皮的形成。22MirandaD.Grounds,etal.TheJournalofHistochemistry&Cytochemistry2002,50(5):589–610干细胞移植23Nature/Vol428/3April2004/664-8145例HSC移植入正常或者损伤的成年小鼠心脏的实验研究，没有发现由干细胞转分化而来的心肌，并且干细胞移植组相对于假移植组心肌细胞数量没有明显的增加，为心肌修复的临床研究提出了质疑。心脏功能上的改善可能是由于移植对左心室重塑的影响或者是产生了新生血管，而不是心肌再生。过去两年来，开展了一些使用骨髓祖细胞进行心脏修复临床试验。在目前研究中，HSC不能转化形成新的心肌，动摇了这些试验的理论基础。造血干细胞（HSC）治疗的不足24干细胞治疗心肌梗死患者的临床试验StudynCellType/TreatmentModeofDeliveryEndPointPJanssensetal67BMMNCsIntracoronaryLVejectionfraction0.36BOOST60BMMNCsIntracoronaryLVejectionfraction0.0026ASTAMI100BMMNCsIntracoronaryLVejectionfraction0.05*REPAIR-AMI204BMMNCsIntracoronaryLVejectionfraction0.021Zohlnhoeferetal114G-CSFSubcutaneousInfarctsize0.79STEMMI62G-CSFSubcutaneousLVsystolicwallthickening1.00BMMNCs骨髓单核细胞;G-CSF,粒细胞集落刺激因子;*LVejectionfractionwashigherinthecontrolgroup.Circulation.2006;114:353-358.25Isstemcelltherapyforcardiacrepairreadyforpatients?26作为一项新生事物，干细胞移植可能是治疗缺血性心脏病令人激动的新选择。尤其是那些有大面积心肌梗死患者，因其预后不佳，更有可能从细胞移植治疗中获益。但迄今为止，临床试验结果相互矛盾，仍然处于实验性治疗阶段。27促进血管新生中医药如何？中医药益气活血、祛瘀生新等许多治疗法则以及临床的有效性，也为中医药血管新生的研究提供了理论和临床依据。28血管新生研究的中医药理论基础“活血生肌”、“袪瘀生新”创伤愈合不良、溃疡不愈、心肌缺血侧枝代偿不足等。戴瑞鸿…，冠心病心肌缺血的治疗性血管生成与中医药中国中西医结合杂志.2000,20(3).-163-16429麝香保心丸的血管新生研究30中西医结合治疗冠心病的特色“血”“脉”两条途径，整体治疗，体现中医药特色活血化瘀复方丹参滴丸丹参片益气活血芳香温通麝香保心丸血脉降低血粘度抗血小板抗凝溶栓血管扩张内皮保护血管新生中西医结合治疗心脑血管疾病3132起效时间：麝香保心丸和硝酸甘油相似，最快30秒，一般在3～5分钟之内心电图有效率：麝香保心丸和硝酸甘油无显著性差异副反应：麝香保心丸的副反应明显低于硝酸甘油。麝香保心丸与硝酸酯类疗效对比85%85%60%0.90%90%80%70%17%0%20%40%60%80%100%即刻疗效7日疗效心电图改善头痛麝香保心丸组硝酸甘油组33保护血管内皮，抑制动脉粥样硬化麝香保心丸能提高内源性一氧化氮合酶(eNOS)基因的表达，增强血管一氧化氮合酶(NOS)活力，以及抗炎、减少脂质浸润等途径保护血管内皮临床可见长期治疗后血管内皮功能改善，动脉粥样硬化程度减轻——与缓释单硝酸异山梨酯（DRIM）比较反应性充血肱动脉内径明显增加5.445.595.689.56024681012DRIM组麝香保心丸组治疗前治疗后0.511.522.5ASP组HMP组正常对照组治疗前治疗6个月治疗1年麝香保心丸组颈动脉IMT显著变薄34麝香保心丸的促血管新生作用对血管生长因子的影响鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）试验大鼠缺血动物模型临床研究（心肌核素显像)对肿瘤及斑块血管新生的影响对骨髓干细胞的动员对生长因子受体的影响（正在进行）尸检回顾性分析（正在进行）35体外细胞学实验麝香保心丸促进培养的牛肾上腺微血管内皮细胞增殖和形成管腔结构（生理盐水对照组细胞）（麝香保心丸组细胞）麝香保心丸促进血管新生作用的证据汪珊珊，李勇等。麝香保心丸对鸡胚绒毛尿囊膜及培养的血管内皮细胞的促血管生成作用，《中国中西医结合杂志》2003,23(2)36麝香保心丸的促血管新生作用的证据体外组织学实验：麝香保心丸能促进鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成作用（加有生理盐水的CAM）（加有麝香保心丸的CAM）汪珊珊，李勇等。麝香保心丸对鸡胚绒毛尿囊膜及培养的血管内皮细胞的促血管生成作用，《中国中西医结合杂志》2003,23(2)37增加心肌梗塞大鼠心肌VEGF含量（免疫组化染色）资料来源:麝香保心丸对实验性心肌梗塞大鼠心脏的促血管生成作用《中成药》2002；24（6）：446-449（生理盐水组）（麝香保心丸组）促进缺血心肌血管生长因子表达3802004006008001234567组别血管面密度(个/mm2)2周8周1、2.小、大剂量麝香保心丸3.贝复济与肝素联用组4.模型组5.假手术组6.正常组7.卡托普利组在体研究：大鼠心肌梗死模型梗死边缘区1234567麝小麝大bFGFMFNK39麝香保心丸对内皮祖细胞的影响A为LSCM激发绿色为结合FITC-UEA-I的EPCs；B为LSCM激发红色的为摄取DiI-Ac-LDL的EPCs；C为LSCM激发呈现橙色为FITC-UEA-I和摄取DiI-Ac-LDL的EPCs（C为正在鉴定的分化祖细胞）梁春、吴宗贵等，中国中西医结合杂志，June2009,Vol.29,No.640麝香保心丸对分化祖细胞的影响与对照组比较，麝香保心丸1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml组可以增加EPCs增殖、迁移、粘附、及体外血管形成能力。不同浓度麝香保心丸对EPCs迁移、粘附、血管形成及分泌NO的影响0102030405060迁移（细胞/×200）粘附（细胞/×200）血管形成（小管/×200）NO含量（μmol/L)对照麝香保心丸1mg/ml麝香保心丸2mg/ml麝香保心丸4mg/ml41中药