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第七章亲和层析法第一节基本原理生物亲和作用：生物物质具有识别特定物质并与该物质的分子相结合的能力。这种识别并结合的能力具有排他性（能区分结构和性质非常相近的其它分子）。亲和层析(AffinityChromatography，AC)是利用生物大分子具有对一类生物大分子特异识别和可逆结合的特性而建立起来的一种分离的色谱方法，也叫做生物亲和或生物特异性亲和色谱。亲和作用的机理1、结构特点（必要条件）：存在凹陷和凸起结构（钥匙和锁孔的关系）2、相互作用力的存在静电作用氢键疏水性相互作用配位键弱共价键影响亲和作用的因素1、离子强度：一般来说，提高离子强度，亲和作用减弱或完成破坏。2、PH：在适当的PH下，亲和结合作用较高，在其它PH下，亲和作用减弱或完成破坏。3、抑制氢键形成的物质：脲和盐酸胍的存在可减弱亲和作用4、温度：提高温度，静电作用、氢键、配位键减弱；但是，疏水性相互作用增强5、液体离子：SCN-、I-、CIO4-的存在，疏水性相互作用减弱6、螯合剂：影响配位键，使亲和作用消失1910年最早利用亲和纯化原理分离蛋白质(不溶性淀粉吸附淀粉酶)。20世纪50年代有意识的利用。1967年亲和纯化技术从理论走向实用(BrCN活化法修饰糖类载体用以偶联伯胺类化合物)。80年代以后，生物亲和作用和其它分离技术的结合。亲和层析已经广泛应用于生物分子的分离和纯化，如结合蛋白、酶、抑制剂、抗原、抗体、激素、激素受体、糖蛋白、核酸及多酶类等；也可以用于分离细胞、细胞器、病毒等。亲和层析的基本特点1、纯化过程简单、迅速，且分离效率高2、特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子3、纯化倍数大，产物纯度高4、必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件5、价格相对较昂贵；6、在洗脱中，交联在层析介质上的配基可能脱落并进入产品中，从而造成不良影响，如抗体、染料等配基。亲和层析原理亲和吸附介质：基质+配体★亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂★当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出★然后改变流动组成份，将结合的亲和物洗脱下来第二节操作一、基质的选择理想的基质应符合下面的要求：1．极低的非特异性吸附。2．高度的亲水性。3．较好的理化稳定性。4．大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配体结合。5．适当的多孔性。一般亲和吸附剂采用的基质有纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖、多孔玻璃珠等。sepharose4B具有层析速度较快，化学稳定性好，非特异吸附少，微球孔径适度，蛋白载量大的特点，并且有大量可供活化的羟基，是亲合层析的理想介质。二、配体的选择理想的配体应具有以下一些性质：1)配体与待分离的物质有适当的亲和力。亲和力太弱，待分离物质不易与配体结合，造成亲和层析吸附效率很低。而且吸附洗脱过程中易受非特异性吸附的影响，引起分辨率下降。但如果亲和力太强，待分离物质很难与配体分离，这又会造成洗脱的困难。总之，配体和待分离物质的亲和力过弱或过强都不利于亲和层析的分离。应根据实验要求尽量选择与待分离物质具有适当的亲和力的配体。2)配体与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异性，也就是说配体与待分离物质有适当的亲和力，而与样品中其它组分没有明显的亲和力，对其它组分没有非特异性吸附作用。这是保证亲和层析具有高分辨率的重要因素。3)配体要能够与基质稳定的共价结合，在实验过程中不易脱落，并且配体与基质偶联后，对其结构没有明显改变，尤其是偶联过程不涉及配体中与待分离物质有亲和力的部分，对二者的结合没有明显影响。4)配体自身应具有较好的稳定性，在实验中能够耐受偶联以及洗脱时可能的的较剧烈的条件，可以多次重复使用。根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为两类：特异性配体（specificligand）和通用性配体（generalligand）。特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结合的配体。如生物素和亲和素、抗原和抗体、酶和它的抑制剂、激素－受体等，它们结合都具有很高的特异性，用这些物质作为配体都属于特异性配体。配体的特异性是保证亲和层析高分辨率的重要因素，但寻找特异性配体一般是比较困难的，尤其对于一些性质不很了解的生物大分子，要找到合适的特异性配体通常需要大量的实验。通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大分子结合的配体，如各种凝集素（lectine）可以结合各种糖蛋白，核酸可以结合RNA、结合RNA的蛋白质等。通用性配体对生物大分子的专一性虽然不如特异性配体，但通过选择合适的洗脱条件也可以得到很高的分辨率。而且这些配体还具有结构稳定、偶联率高、吸附容量高、易于洗脱、价格便宜等优点，所以在实验中得到了广泛的应用。亲和吸附介质的配基（1）酶的抑制剂一些物质，它们并不引起酶蛋白变性，但能使酶分子上的某些必需基团（主要是指酶活性中心上的一些基团）发生变化，因而引起酶活力下降，甚至丧失，致使酶反应速度降低，能引起这类抑制作用的物质称为酶的抑制剂（inhibitor）。在生物体内蛋白酶的抑制剂可与蛋白酶的活性部位结合，抑制酶的活性，必要时保护生物组织不受蛋白酶的损害。酶的抑制剂在分子大小和形态上分布较广，有天然的生物大分子，也有小分子化合物。例如胰蛋白酶的天然蛋白质类抑制剂有胰脏蛋白酶抑制剂（pancreatictrypsininhibitor，PTI），卵粘蛋白（ovomucoid）和大豆胰蛋白酶抑制剂（soybeantrypsininhibitor，STI）等，小分子抑制剂有苄脒（benzamidine）、精氨酸和赖氨酸。这些抑制剂均可作为亲和纯化胰蛋白酶的配基，但与酶的结合常数各不相同。例如，STI与胰蛋白酶的结合常数达109L/mol以上，而对氨基苄脒（p-aminobenzamidine）与胰蛋白酶的结合数约为4×104L/mol（25℃）。（2）抗体利用抗体为配基的亲和层析又称为免疫亲和层析（Immunoaffinitychromatography）。抗体与抗原之间具有高度特异性结合能力，结合常数一般为107～1012L/mol。因此，利用免疫亲和层析法，特别是以单抗为配基的免疫亲和层析法是高度纯化蛋白质类生物大分子的有效手段。但是单抗或者利用动物免疫实验从动物腹水中获得，或者通过动物细胞培养获得，是一种昂贵的生物活性物质，很难大规模使用。不过，对于产量较小的基因工程药物如组织纤溶酶原激活剂（tissue-typeplasminogenactivator，t-PA）、干扰素（interferon）等的分离纯化，单抗免疫亲和层析法的确是非常有效的纯化手段。利用多克隆抗体为配基时，只要选择适当的洗脱条件，也可进行目标产物的高度纯化。（3）A蛋白A蛋白（proteinA）为分子量约42KD的蛋白质，存在于黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）的细胞壁中，占该细胞壁构成成分约5％。A蛋白在确定其为蛋白质之前称A抗原，与动物免疫球蛋白G(immunogloblinG，IgG)具有很强的亲和结合作用，结合部位IgG分子的Fc片断（Y字型IgG分子的主干部分）。每个A蛋白分子上含有5个Fc片断结合部位。除IgG外，A蛋白与人IgM和人IgA也具有亲和结合作用，但结合力较弱。A蛋白不与抗体（IgG）的抗原结合部位结合，而且任何抗体的Fc片断的结构都非常相似，因此A蛋白可作为各种抗体的亲和配基，但不同抗体的结合常数有所不同。此外，A蛋白与抗体结合并不影响抗体与抗原的结合能力，因此A蛋白也可用于分离抗原-抗体的免疫复合体。（4）凝集素凝集素(lectin)是与糖特异性结合的蛋白质（酶和抗体除外）的总称，大部分凝集素为多聚体，含有两个以上的糖结合部位，不同的凝集素与糖结合的特异性不同。例如，常用做亲和配基的伴刀豆球蛋白A(concanavalinA，conA)与葡聚糖和甘露糖的亲和结合作用较强，而麦芽糖凝集素（wheatgermagglutinin，WGA）与N-乙酰葡糖胺（N-acetyl-glucosamine）的亲和结合作用较强。ConA可用做糖蛋白、多糖、糖脂等含糖生物大分子以及全细胞、细胞膜片断和细胞表面受体蛋白的亲和配基。pH＜5.6时conA为二聚体，分子量为52KD；pH＞5.6时为四聚体，分子量为102KD，每个亚基（subunit）之间通过二硫键结合。因此，在利用conA为配基的亲和层析操作中，操作条件（pH，溶液组成）应当适宜，不能使conA的亚基发生解离。（5）辅酶和磷酸酰苷各种脱氢酶和激酶需要在辅酶（coenzyme）的存在下表现其生物催化活性，即脱氢酶和激酶与辅酶之间具有亲和作用。辅酶主要有辅酶Ⅰ（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，nicotinamideadeninedinucleotide，NAD）、辅酶Ⅱ（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，NADphosophate，NADP）和三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP）等。这些辅酶可用做脱氢酶和激酶的亲和配基。此外，磷酸腺苷（adenosine5’-monophosphate，AMP）、二磷酸腺苷（adenosine2’，5’-diphosphate，ADP）的腺苷部分与上述辅酶的结构类似，与脱氢酶和激酶同样具有亲和结合作用，可用做这些酶的亲和配基。（6）过渡金属离子Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+等过渡金属离子可与N、S和O等供电原子（electrondonoratom）产生配位键，因此可与蛋白质表面的组氨酸（His）的咪唑基、半胱氨酸（Cys）的巯基和色氨酸（Trp）的吲哚基发生亲和结合作用，其中以His的咪唑基的结合作用最强。过渡金属离子与咪唑基的结合强弱顺序是Cu2+＞Ni2+＞Zn2+≥Co2+。过渡金属离子可通过与亚胺二乙酸（iminodiaceticacid，IDA）或三羧甲基乙二胺[tris(carboxymethyl)-ethylenediamine，TEP]形成鳌合金属盐固定在固定相粒子表面，用做亲和吸附蛋白质的配基。这种利用金属离子为配基的亲和层析一般称为金属螯合层析（Metalchelatechromatography）或固定化金属离子亲和层析（Immobilizedmetalaffinitychromatography，（7）组氨酸在各种氨基酸中，组氨酸的性质比较独特：具有弱疏水性、咪唑环为弱电性。因此组氨酸可与蛋白质发生亲和结合作用。虽然这种亲和作用的机理尚不十分清楚，但利用固定化组氨酸吸附蛋白质以及吸附蛋白的洗脱实验结果表明，静电和疏水性相互作用均有可能参与亲和结合。在盐浓度较低和pH约等于目标蛋白质等电点的溶液中，固定化组氨酸的亲和吸附作用最强，随着盐浓度增大，亲和吸附作用降低。因此利用组氨酸为配基可亲和分离等电点相差较大的蛋白质，洗脱则可采用增大盐浓度的梯度洗脱法。（8）肝素肝素（heparin）是存在于哺乳动物的肝、肺、肠等脏器中的酸性多糖类物质，分子量一般为5～30KD，具有抗凝血作用。肝素与脂蛋白、脂肪酶、甾体受体、限制性核酸内切酶、抗凝血酶、凝血蛋白质等具有亲和作用，可用作这些物质的亲和配基。肝素的亲和结合作用在中性pH和低浓度盐溶液中较强，随着盐浓度的增大结合作用降低三、亲和吸附剂的制备1．活化基质的活化是指通过对基质进行一定的化学处理，使基质表面上的一些化学基团转变为易于和特定配体结合的活性基团。（1）、溴化腈活化法溴化氰活化法是最常用的活化方法之一，活化过程主要是生成亚胺碳酸活性基团，它可以和伯氨(NH2)反应，主要生成异脲衍生物。反应如下：这种方法的缺点是溴化氰活化法的基质和配体偶联后生成的异脲衍生物中氨基的pKa＝10.4，所以通常会带一定的正电荷，从而使基质可能有阴离子离子交换作用，增大了非特异性吸附，影响亲和层析的分辨率。另外溴化氰活化的基质与配体结合不够稳定，尤其是当与小配体结合时，可能会出现配体脱落