微小RNA及其在医学中的应用

微小RNA及其在医学中的应用蔡俊超中山医学院微生物教研室一、microRNA的研究历史二、microRNA的特点和作用机制三、microRNA与疾病及潜在的治疗作用四、microRNA研究的一般步骤和方法五、以一篇文章为例介绍一下研究的过程DNARNA蛋白质基因组学RNA组学蛋白质组学后基因组时代的中心法则RNA加工基因调节DNA修复和重组基因组的保持基因组的表达后基因组时代的基因调控：RNA调控2006年的诺贝尔生理学奖获得者：AndrewZ.FireCraigC.Mello一、microRNA的研究历史人类基因组中，蛋白质编码区只占1-2％。其它98％的基因组有什么功能呢？约24％为内含子序列，这么冗长的内含子序列有什么生物学功能呢？micoRNA(miRNA)是广泛存在于真核生物中的一组短小的、不编码蛋白质的RNA家族，它们是由19-23个核苷酸组成的单链RNA（3‘端可有1~2个碱基长度的变化）表达具有组织特异性和阶段特异性。即：在不同组织中表达有不同类型的miRNA,在生物发育的不同阶段里有不同的miRNA表达与靶mRNA3’-UTR结合，序列特异性的在转录后水平调控基因的翻译表达，在生物发育、脂肪代谢、细胞的分化、增殖和凋亡等过程中发挥着重要作用•第一个被发现的miRNA(lin-4)由哈佛大学的VictorAmbros发现的（1993）•第二个被发现的miRNA（let-7）由哈佛大学的博士后FrankSlack(Ruvkun实验室）发现的（2000)VictorAmbrosGaryRuvkun微小RNA（microRNA,miRNA）的发现199320002001200220032004200520062007microRNA的研究历史Dr.VictorAmbros1993200020012002200320042005200620071993200020012002200320042005200620071993200020012002200320042005200620072001年命名为microRNA1993200020012002200320042005200620072002年入选《science》年度十大科学发现之首199320002001200220032004200520062007ThefirstdemonstrationofalinkbetweenmiRNAgenesandcancer.199320002001200220032004200520062007miRNAcontrolssomeplantphenotype199320002001200220032004200520062007Thefirstquantitativereal-timePCRdevelopedformiRNAprofiling,designedfortheamplificationofprecursormolecules.199320002001200220032004200520062007ThefirststudytoreportonmiRNAprofilingusinganoligonucleotidemicrochip.Thefirstpapertoexplore,byusinggenome-widemiRNAprofilingbymicroarray,thepotentialimportanceofmiRNAsinthediagnosisandprognosisofahumanmalignancy199320002001200220032004200520062007AnelegantstudythatshowsapathogeneticlinkbetweenmiRNAsandtargetoncogenes.199320002001200220032004200520062007ThefirstpapertoshowthatthederegulationofasinglemiRNAgenecanleadtocancer.199320002001200220032004200520062007通过生物信息的手段分析了microRNA在蛋白相互作用网络和转录因子-microRNA相互调控网络中的作用19932000200120022003200420052006200721-ntdsRNAstargetingselectedpromoterregionsofhumangenescausedlong-lastingandsequence-specificinductionoftargetedgenes199320002001200220032004200520062007Nature449,682-688(11October2007)|199320002001200220032004200520062007SangerRelease10.0contains5071hairpinprecursormiRNAs,expressing4922maturemiRNAproducts,inprimates,rodents,birds,fish,worms,flies,plantsandvirusesinAugust2007近年来被鉴定的miRNAs越来越多至今超过17000miRNAs已被发现可以免费获得二、microRNA的特点和作用机制microRNA分布miRNA名称与编号1)miRNA成熟体命名规则(以动物miRNA为例)①miRNA成熟体简写成miR，再根据其物种名称，及被发现的先后顺序加上阿拉伯数字，如hsa-miR-122；②高度同源的miRNA在数字后机上英文小写字母(a,b,c,…)，如hsa-miR-34a，hsa-miR-34b，hsa-miR-34c等；③由不同染色体上的DNA序列转录加工而成的具有相同成熟体序列的miRNA，则在后面机上阿拉伯数字以示区分，如hsa-miR-199a-1和hsa-miR-199a-2；④通常一个miRNA前体长度大约为70~80nt，很可能两个臂分别产生miRNA以前的做法是：表达水平较高的miRNA后面不加任何符号，而表达水平较低的miRNA后面加上*号，如rno-miR-9*。有时带“*”的miRNA就根本不出现。在miRBase19.0中则以“-5p”和“-3p”分别命名。如hsa-miR-26b-5p和hsa-miR-26b-3p，分别表明从hsa-mir-26b前体的5’端臂和3’端臂加工而来的。/~-OHmatureandprimarymicroRNA的结构Pri-miRNADroshaCleavagesiteMature5‘3’RNA诱导沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)组分Dicer酶：具有RNaseIII结构域,在RNAi的起始阶段负责催化siRNA的产生,在RISC装配过程中起稳定RISC中间体结构和功能的作用,Argonaute蛋白：是RISC中的核心蛋白,有PAZ和PIWI两个主要的结构域,前者为siRNA的传递提供结合位点,后者是RISC中的酶切割活性中心;siRNA是RISC完成特异性切割作用的向导siRNA/mRNA：5endofthesmallRNA,2–8,knownasthe‘seed’regiondonothaveacomplexsecondarystructureandarelocatedinaccessibleregionsoftheRNAmicroRNA识别靶位点microRNA的加工成熟与分布据体内外实验研究表明miRNA的生成需要两个步骤：1)由长的内源性转录本（pri-miRNA)经Drosha酶作用生成70nt左右的miRNA前体(pre-miRNA)，该过程发生在细胞核2)将pre-miRNA经Dicer酶作用加工为成熟miRNA，该过程发生在细胞质中。microRNA的加工成熟microRNA是动、植物自身基因组编码形成的一类小分子首先由基因组转录形成长链RNA分子——pri-miRNA约60%的microRNA为独立转录表达；约15%miRNA为成簇存在而共同转录；其余还有约25%的miRNA定位于功能基因内含子，随基因转录表达。Pri-miRNA经双链RNA核酸酶Drosha酶作用，加工形成70-100nt长度的pre-miRNAPre-miRNA在Exportin5介导作用下转运出胞核至胞质中进行下一步加工Pre-miRNA在胞质中经双链RNA核酸酶Dicer酶作用加工形成单链成熟miRNA分子miRNA的加工成熟过程与RNAi技术中常用的siRNA有许多相似之处——均经过Dicer酶对双链RNA的识别加工而形成单链RNA分子。Thetargetspecificity,andprobablyalsothefunctionalefficiency,ofamiRNArequiresthatthematuremiRNAstrandfromthemiRNA:miRNA*duplexbeselectivelyincorporatedintotheRISCfortargetrecognition.ThemiRNA*strandisprobablydegradedrapidlyonitsexclusionfromtheRISC,astherecoveryrateofmiRNA*fromendogenoustissuesis~100-foldlowerthanthatofmiRNAs.thestabilityofthe5’endsofthetwoarmsofthemiRNA:miRNA*duplexisusuallydifferent,miRNAsisalmostalwaysderivedfromthestrandwiththelessstable5’endcomparedwiththemiRNA*strand.microRNA的作用机制miRNA发挥作用过程19-23nt的成熟miRNA形成后与其他蛋白共同组成RNA介导的沉默复合体（RISC）参与RNA干扰途径miRNA形成RISC复合体后可与特定的靶mRNA结合，这种结合不要求严格的互补配对。结合后导致靶mRNA翻译的抑制翻译抑制5’endofthesmallRNA,2–8,knownasthe“seedregion”donothaveacomplexsecondarystructureandarelocatedinaccessibleregionsoftheRNAmicroRNA识别靶位点microRNA作用机制miRNPs=miRNA+RISC微小RNA的作用特点•主要是在蛋白质水平调控•５’端２-８个核苷酸高度保守，主要作用在靶mRNA的３’端非翻译区（unstranslatedregion,UTR）•分完全和不完全配对两种方式，哺乳动物主要为不完全配对结合，影响mRNA的成熟、转运、稳定性或者在直接调控翻译•是翻译抑制还是剪切mRNA，除配对因素外，还取决于RISC中组装元件的功能，如Arg蛋白miRNA与siRNA的联系：均为Dicer的产物长度均为22nt左右，5’端是磷酸基，3’端是羟基均需Argonaute家族蛋白的存在同为RISC的组分二者进化关系上可能的两种推论：siRNA是miRNA的补充miRNA在进化过程中替代了siRNA沉默机制有重叠miRNAsiRNA产生细胞内RNA的固有组分之一（正常）RNAi的活性形式，病毒感染和人工插入dsRNA之后诱导而产生（异常）来源内源转录本转基因或病毒RNA（外源）直接来源发夹状pre-miRNA长dsRNA结构单链双链，3‘端有2个非配对碱基，通常为UU互补性不完全互补，存在错配现象完全互补对靶RNA特异性相对较低，一个突变不影响miRNA的效应较高，