第一章 植物组织培养实验室的构建和操作技术

第一章组培的基本条件及一般技术植物组织培养第一章植物组织培养实验室的构建和操作技术第一章组培的基本条件及一般技术第一节实验室及主要设备第一章组培的基本条件及一般技术主要内容植物组织培养的设计原则组培室的组成及其功能无菌操作设备常用工具常用仪器设备第一章组培的基本条件及一般技术组织培养实验室布局的总体要求便于隔离便于操作便于灭菌便于观察第一章组培的基本条件及一般技术实验室设计原则：保证无菌操作，达到工作方便，防止污染。实验室的大小应取决于工作的目的和规模按组织培养流程来设计，避免某些环节倒排，引起日后工作混乱利用一定的设备、器材和特殊的实验室结构设计，达到严格无菌的条件第一章组培的基本条件及一般技术一、实验室设置及仪器设备实验室是进行组培研究的主要场所，应能满足清洗、培养基制备、储藏、无菌操作、培养、鉴定等多方面的工作。第一章组培的基本条件及一般技术辅助实验室实验室组成准备室缓冲室无菌操作室培养室细胞生物学实验室温室生化分析实验室基本实验室1.构成与配置基本实验室布局平面图实验台搁架培养架培养架培养架培养架药品及仪器柜无菌台无菌台搁架拉窗冰箱搁架水槽电炉门4.5m3.0m3.5m4.0m准备室缓冲室无菌室培养室AGlimpseofPlantTissueCulture第一章组培的基本条件及一般技术（1）准备室所需器具的清洗、干燥和保存培养基的配制和灭菌生理生化测定等组织培养准备实验室1）洗涤间根据工作量的大小决定其大小，一般面积控制在30-50m2。在实验室的一侧设置专用的洗涤水槽，用来清洗玻璃器皿。中央实验台还应配置2个水槽，用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大，可以购置一台洗瓶机。准备1-2个洗液缸，专门用于洗涤对洁净度要求很高的玻璃器皿。此外还应配置落水架、干燥箱、柜子、超声波清洗器等。地面应耐湿并排水良好。面积60平方米左右，配备的主要仪器设备有：冰箱、天平、微波炉、pH计、培养基分装器、药品柜、器械柜、抽气泵、电炉、各种规格的培养瓶、培养皿、移液管、烧杯、量筒、容量瓶、储藏瓶等。冰箱以体积180-200L为宜，用于储存培养基母液、激素维生素等贵重药品、彩色胶卷、及保存植物材料。天平应有不同感量。2）培养基配制间配备实验台、高压灭菌锅、排风灭火设备、细菌过滤设备、干热消毒柜、电炉等。灭菌锅的选择应根据不同的要求选择不同型号的灭菌锅。一般实验室可选用小型的医用手提式高压灭菌锅，较大的实验室可选用立式自动控制压力和温度的灭菌锅。生产性的实验室可选用大型的卧式灭菌锅。如果没有条件的话，可以将上述工作间合并成一个准备间，要求是设备的安装和排列要合理、房间要宽敞、明亮、透风，地面要便于清洁、防滑。3）消毒间（2）缓冲室（注意门的朝向）•工作人员在此换上工作服、拖鞋，戴上口罩•功能减少人体从外界带入的尘埃等污染物。•要求缓冲间需3-5平方米，应保持清洁无菌；有清洁的实验用拖鞋、已灭菌过的工作服；1-2盏紫外灯定时照射，对衣物及空间进行灭菌。无菌操作室主要用于实验材料的接种操作，所以又叫接种室。通常由里外两间组成，外间是缓冲间，用于准备工作，还有防止污染的作用。缓冲间的门应该与接种室的门错开，两个门也不要同时开启，以保证无菌室不因开门和人的进出带进杂菌。缓冲间内应该设有水槽、实验台、鞋帽架、和柜子、紫外灯。无菌操作室的内壁应当用塑钢板或瓷砖装修，工作人员进入操作间前要穿上消过毒的工作服和拖鞋。室内应配有超净工作台，紫外灯、解剖镜、各种接种器械等。（3）无菌操作室无菌室（一）无菌室（二）为了控制培养室的温度和光照时间及其强度，培养室的房间不要窗户，但应当留一个通气窗，并安上排气扇。室内温度由空调控制，光照由日光灯控制。天花板和内墙最好用塑料钢板装修，地面用水磨石或瓷砖铺设，一般要分两间，一为光照培养室，一为暗培养室。培养室外应有一预备间或走廊。培养室应配有培养架、转床、摇床、光照培养箱、生化培养箱、自动控时器等。日光灯一般用40W，固定在培养架的侧面或搁板的下面，每层有两支日光灯，距离在20cm，光照强度为2000-3000lx。（4）培养室培养室植物组织培养材料移到田间前，通常先移到温室进行练苗，待生根成活后，再移到大田。2．辅助实验室（1）鉴定室细胞学鉴定室其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。应配置各种显微镜、照相系统等。生化分析室在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。离心机、酶联免疫检测仪、天平、PCR仪等。为试管苗提供满足生长的适宜环境条件。（2）温室二、仪器和设备（一）无菌操作设备１.烘箱：作用：干燥洗后的器皿高温干热灭菌测定培养物的干重时烘干培养材料。2.灭菌锅类型：普通医用消毒锅大的高压灭菌锅作用：培养基、水和各种用具的消毒医用手提式灭菌锅不锈钢立式灭菌锅3.超净工作台陈列于操作室（接种室）内类型：垂直式和水平式作用：无菌操作（二）药品贮存和配制仪器设备1.冰箱作用：低温保存材料，存放药品、培养基母液、激素、酶制剂。2.天平陈列于制备室中作用：称取大量元素、微量元素、酶制剂3.酸度计陈列于制备室中作用：测定培养基及酶制剂的pH值PHS-802中文台式酸度计通用型或经济型酸度计（三）观察分析仪器设备显微镜类型：倒置显微镜原生质体观察普通显微镜染色体和叶片气孔观察荧光显微镜细胞活力观察电子显微镜病毒检测、细胞器变化体视显微镜形态分化的实体观察（四）培养设备1.空调作用：控制培养温度2.加湿器和去湿机控制培养室内湿度状况3.定时器控制光照时间4.培养架盛放培养物5.摇床和旋转床进行液体培养时用以改善气体状况小型臭氧发生器不锈钢蒸馏水器（单蒸水）三、玻璃器皿及用具（一）玻璃器皿1.培养器皿培养用的：试管、三角瓶、培养皿等2.分注器类型：注射器式分注器、漏斗式分注器、量筒漏斗式分注器3.其他玻璃仪器烧杯、量筒、移液管、容量瓶、试剂瓶等（二）器械类1.镊子类型：枪式镊子（接种、转移）、尖头镊子（茎尖）2.剪刀类型：大剪刀、小剪刀、弯头剪刀3.解剖刀类型：固定式和活动式4.接种针用来转移细胞或愈伤组织5.细菌过滤器用来去除细菌（高温的影响）1.洗涤液的配制二、实验基本操作（一）洗涤技术A、新购买的玻璃仪器表面常附着有游离的碱性物质，可先用0.5％的去污剂洗刷，再用自来水洗净，然后浸泡在1％～2％盐酸溶液中过夜（不可少于四小时），再用自来水冲洗，最后用无离子水冲洗两次，在100℃～120℃烘箱内烘干备用。2.洗涤方法先用自来水洗刷至无污物，再用合适的毛刷沾去污剂（粉）洗刷，或浸泡在0.5％的清洗剂中超声清洗（比色皿决不可超声），然后用自来水彻底洗净去污剂，用无离子水洗两次，烘干备用（计量仪器不可烘干）。清洗后器皿内外不可挂有水珠，否则重洗，若重洗后仍挂有水珠，则需用洗液浸泡数小时后（或用去污粉擦洗），重新清洗。B、使用过的玻璃仪器的清洗聚乙烯、聚丙烯等制成的塑料器皿，在生物化学实验中已用的越来越多。第一次使用塑料器皿时，可先用8mol/L尿素（用浓盐酸调pH=1）清洗，接着依次用无离子水、1mol/LKOH和无离子水清洗，然后用10—3mol/LEDTA除去金属离子的污染，最后用无离子水彻底清洗，以后每次使用时，可只用0.5％的去污剂清洗，然后用自来水和无离子水洗净即可。C、塑料器皿的清洗金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤（新的可以用热洗衣粉水洗净），需要清洗时，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。E、除菌过滤器用清水冲洗后，用洗液冲洗，再用清水冲洗，最后用蒸馏水冲洗，晾干备用。D、金属用品洗涤1.灭菌工作是极其重要的。首先应建立有菌和无菌的概念有菌的范畴：有菌：凡是暴露在空气中的物体，至少其表面都是有菌的。如植物的表面、超净工作台的台面，未处理的工具和手等。无菌：高压高温处理（工具、器皿、培养基等）物理或化学处理；火烤后的物体；健康的动植物不与内外部表面接触的组织内部可能是无菌的（有时也有内生菌，但不会影响培养，也不会污染）（二）灭菌技术（1）物理方法：干热、湿热、过滤（0.25微米）紫外灯、超声波等。（2）化学方法：使用灭菌剂或抗菌素，如酒精、次氯酸钠、升汞、漂白粉、高锰酸钾、双氧水、福尔马林等2.灭菌的方法干热灭菌玻璃器皿、器械湿热灭菌培养基、蒸馏水、器械、棉塞等熏蒸灭菌接种室、培养室过滤灭菌液体培养基、蒸馏水药剂灭菌培养材料烧灼灭菌器械、瓶口、棉塞、包头纸辐射灭菌接种室。培养间各种灭菌方法及其使用范围适用于玻璃器皿和金属器械的灭菌。操作方法：150℃、40min或120℃、120min，如果发现芽孢杆菌，160℃、90～120min1）干热灭菌适用于各种器皿、培养基、器皿、蒸馏水、棉塞、纸等。121℃维持20～30min注意点：加足水、排尽气、气压降到0时，才能开盖2）湿热灭菌培养基的灭菌一般用高压高温处理，但如果培养基中某些成分遇到高温分解（如某些生长调节剂GA3、玉米素等），就需要过滤灭菌。另外酶、血清等也需要过滤灭菌灭菌方法：将生长调节剂或酶配成一定浓度，用注射器注入微孔滤膜虑，滤膜孔径0.22～0.45微米。制培养基时，现将培养基高压灭菌，待降至50℃左右时，加入适量的激素，然后分装。3）过滤灭菌主要是利用紫外灯进行照射，适合实验室空气、操作台等，灭菌时间20～30min。注意：关灯后5min后再进入。超净工作台关灯后要打开风机。4）射线灭菌用火焰灼烧达到灭菌目的，适用于接种器皿的灭菌。5）火焰灼烧灭菌适用外植体、实验器皿、操作表面、皮肤等。几种常用消毒剂的效果比较消毒剂使用浓度(%)消毒时间(min.)效果残液去除难易乙醇70-750.1-3好易新洁尔灭10～205～30好易氯化汞0.1～12～15最好最难过氧化氢10～125～15较好最易抗菌素4～50mgl-130～60较好较难次氯酸钙/纳9～105～30好易6）消毒剂长期不用的培养室或接种室要进行熏蒸。方法：甲醛、高锰酸钾熏蒸。甲醛的用量通常按每立方米空间2-6毫升计算，高锰酸钾的用量是甲醛的一半。室内准备妥当后，把称好的高锰酸钾放在瓷碗或烧杯内(最好在碗或杯下面铺一张报纸，以利清洗)，然后将甲醛也倒入碗或杯内，立即出屋关门。几秒钟后，甲醛溶液即沸腾挥发。高锰酸钾是一种氧化剂，当它与一部分甲醛作用时，由氧化反应产生的热可使其余的甲醛挥发为气体。7）熏蒸灭菌甲醛熏蒸接种室应至少在使用前24小时进行，熏蒸后密闭保持4小时以上再进入室内工作。甲醛对人的眼、鼻有强烈刺激作用。因此，可在使用前用氨进行中和。取与甲醛等量的氨水，倒在另一个烧杯里，迅速放入熏蒸室内，使甲醛和氨水发生中和反应，以消除甲醛味，减少对人体的刺激作用。使用氨水应在工作前2小时进行。对有材料的培养室，也可以采用乙二醇加热熏蒸人为因素（工作人员本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。物品因素器皿和用具培养皿：洗→热压玻璃器皿：洗→干热（干热箱）或晾干接种用具：用CCL4布擦→湿布擦→泡75%~95%酒精→烧培养基：湿热培养材料外部细菌：用水冲洗→化学药剂处理内部细菌茎尖培养加抗生素：青霉素、利福平操作的空气：洗刷地板95%酒精擦超净工作台用化学试剂薰蒸污染来源（三）无菌操作技术1.实验器具和材料的准备2.用75%的酒精擦拭超净工作台，然后室内及超净工作台用紫外灯杀菌20min-30min。注意：台面上的用品不要放置太多或重叠放置，以免降低灭菌效果。3.关紫外灯、打开风机，过5-10min进入缓冲间，以75%洗手和手臂，更换无菌服、帽子和口罩。进入接种室。（注：没有特别情况，尽量不要下工作台）4.用70－75％的酒精拭擦台面并消毒双手。试验用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器械在其火焰上灼烧，冷却待用。注意：所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。金属器械不能过度灼烧，以防退火。移液管不能灼烧，培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不能时间太长。5.取流水冲洗（至少30min）过的外植体，用一定的