第四章 大分子的分离和分析

1第四章大分子的分离和分析•蛋白质的SDS-PAGE•分子杂交•生物芯片技术•DNA的分离、检测和纯化•RNA的分离、检测和纯化•RNAi技术2目的物种或细胞的基因组DNA第一节DNA的分离、检测和纯化DNA是基因的物质载体，这些载体和基因绝大多数是以质粒的形式保存在大肠杆菌中，基因操作是从大肠杆菌开始的。克隆载体和装载在载体中的克隆化基因两类DNA3一、E.coli质粒DNA的分离和纯化1.E.coli质粒DNA的小量提取（1）碱裂解（变性）法：原理：在pH值12.0～12.5范围内时，共价闭合环状质粒DNA和线性的DNA都会被变性，由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然缠绕在一起不分开；但后者完全变性分离甚至出现断裂，因此，当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值，使溶液pH值恢复较低的近中性水平时，质粒的两条小分子单链可迅速复性恢复双链结构，但是主染色体DNA则难以复性。在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒DNA留在上清夜中。再由异丙醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒DNA。碱裂解法提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析等。4碱裂解法提取质粒DNA的方法是经典的方法，由Birnboim和Doly设计并于1979年发表。溶液Ⅰ（solutionⅠ）：悬浮细胞。该溶液中含有50mM的葡萄糖。溶液Ⅱ：2倍溶液Ⅰ体积。该溶液含有0.2MNaOH和1%SDS。细胞会很快破裂，使混浊的细胞悬液变成完全澄清的粘稠液体。此时，由于在pH12.0-12.5这样狭小的范围内，线性染色体DNA发生变性，而质粒DNA（cccDNA）不会变性。溶液Ⅲ：1.5倍溶液Ⅰ体积。该溶液为高浓度的醋酸钾缓冲液（3M,pH4.6）。在中和过程中，高分子量的染色体DNA复性并聚积成不溶的沉淀，同时高浓度的盐引起蛋白质与SDS复合物以及大分子的DNA形成沉淀。而质粒DNA是环状的，在变性之后经过中和仍保持环状，处于可溶解状态。经高速离心，上清液即为质粒DNA粗制品。5碱变性法的步骤：1）取1.5毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在微量离心管中，离心收集细胞沉淀；2）加入100ul冰冷的bufferⅠ液，（50mM葡萄糖，25mMTris-HClpH=8.0,10mMEDTA，4~5mg溶菌酶）静置5分钟；3）加入200ul室温的bufferⅡ液（0.2MNaOH，1.0%SDS）快速颠倒三下混匀,冰浴5分钟。65℃水浴一段时间会加强染色体DNA的变性作用。4）加入150毫升冰冷的bufferⅢ，振荡后，冰浴5分钟。5）离心的上清液用苯酚抽提数次（此步骤可省略），用乙醇沉淀收集质粒DNA。6影响质粒DNA产量的因素：1）寄主菌株的遗传背景使用限制性内切酶基因发生突变的菌株DH5α、JM109从野生型的菌株中提取质粒须采取的措施：选择最适的培养条件，以限制在细胞生长期间，体内核酸内切酶的表达；在纯化质粒DNA的过程中，用加热法使核酸内切酶失活；采用最佳的实验流程，减少核酸内切酶的污染并在纯化了质粒DNA之后，迅速除去污染的核酸酶。2）质粒的拷贝数及分子的大小插入分子量大的外源DNA会引起质粒拷贝数的下降。789通过试剂盒分离纯化E.coli质粒DNAQiaGen质粒纯化试剂盒10二、DNA的电泳检测分离纯化的DNA是否存在，是否降解，DNA经限制性内切酶酶切后其产物的大小如何等—检测主要检测：分子量DNA浓度1．琼脂糖凝胶电泳agarosegelelectrophoresis琼脂糖：从海藻中提取的一种线状高聚物，在0.7%的琼脂糖浓度下，对0.8～10kb的DNA有最佳的分离效果。常规熔点低熔点：gellingpoint25℃20-30℃meltingpoint≤65℃11琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同12电压：迁移率与电压成正比。一般电场的大小为5伏/厘米左右。＞2kb，应＜5V/cm电场方向：DNA样品都是约pH8.0进行保藏或分析的，在这一pH条件下，DNA是带负电的。因此DNA的泳动方向是从负极走向正极。温度：4℃-30℃，琼脂糖浓度＜0.5%或低熔点4℃缓冲液：TAETBETPE50mMpH7.5-8.0DNAMarker：在电泳进程中，常用一个已知含量和相对分子质量的DNA样品做对照，用来比对待测样品的相对分子质量和含量13核酸电泳缓冲液有三种：Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE)。TBE与TPE缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀。TAE缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TBE。缓冲液中的EDTA可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解.14泳动速率：DNA样品在电泳时的泳动速率与相对分子质量的大小成反比。对相对分子质量相同的DNA分子，其物理构象越接近球状，泳动时遇到的阻力就越小，泳动就越快。DNA构象：质粒DNA有三种构象，即闭合环状超螺旋（ccc型）、线状和缺口环状（nick），它们的泳动速率依次递减。上样缓冲液loadingbuffer：含有40%的蔗糖，用于将DNA样品沉积在点样孔内，使样品不易扩散；还含有溴酚兰等指示剂，用于观察电泳的进程。染色：溴化乙啶（EB）可很好地掺入到双链DNA中，在紫外光UV的激发下会发出橙红色的荧光，可用于对DNA进行染色和观察。UV波长：长366nm一般302nm短254nm15质粒DNA及其酶切产物的琼脂糖凝胶电泳162．聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrohoresis，PAGE）一般在变性条件下使用，主要用来检测小分子核酸的大小，或在同位素标记的情况下分析单链核酸，如分离寡核苷酸探针、S1核酸酶产物分析和DNA测序等。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED(N，N，N，N'一四甲基乙二胺)和过硫酸铵的作用下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂N，N'一亚甲双丙烯酰胺参与下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶17非变性：迁移率与序列和组成有关变性（尿素/甲醛）：无关，分离探针，S1核酸酶产物分析、DNA测序优点：分辨率高，可很好的分离100bp-1kb大小的核酸分子，对单链核酸来说，其分辨率可达1bp点样量大，10ug回收的DNA纯度高18三、DNA片段的纯化（从agarose）DNA经过酶切并通过琼脂糖凝胶电泳分析在凝胶上会呈现DNA条带，从中分离特定大小的DNA片段可用于进一步深入的研究1．低熔点琼脂糖凝胶电泳法2．透析袋电洗脱法3．GlassMilk（bead）结合法4．Qiagen纯化柱191．低熔点琼脂糖凝胶电泳法低熔点琼脂糖在水溶液中的溶解温度（meltingpoint）很低，在65℃以下；当温度降低到20-30℃时凝结成固形物如果需要分离特定的DNA片段，可用低熔点琼脂糖凝胶进行分析，然后切割带有目标DNA的琼脂糖凝胶块，加入适量缓冲液，加热到60℃，凝胶溶化，DNA进入水溶液中，最后通过苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀获得纯化的DNA片段202．透析袋电洗脱法将含有目标DNA片段的琼脂糖凝胶块切割下来，放在透析袋中，置于电泳缓冲液中电泳，DNA将从凝胶块中“跑”出来，贴在透析袋内壁上。取出凝胶块，更换缓冲液，反方向电泳，使DNA游离于缓冲液中。取出含DNA的缓冲液，通过苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀获得纯化的DNA片段。常用于回收5kb以上的DNA片段。213．GlassMilk（bead）结合法琼脂糖凝胶在3倍体积的3MNaI溶液作用下于55℃会溶化，从而将DNA释放到水溶液中；在这样的高盐浓度下，有一种硅珠（glassbead，硅的细微颗粒，其水溶液呈牛奶状，故亦称玻璃奶，glassmilk）可特异性吸附DNA。当硅珠吸附DNA后，通过离心的方法很容易对硅珠进行洗涤，然后用水或低盐缓冲液可从硅粒中将吸附的DNA洗脱出来。。操作简便，效率高回收的DNA的大小有限制，不超过10kb，否则效率很低224．Qiagen纯化柱在3倍体积的特殊高盐溶液作用下于55℃溶化带目的DNA片段的琼脂糖凝胶块，将DNA释放到水溶液中，再通过Qiagen纯化柱，经过结合-洗涤-洗脱步骤，直接得到纯化的DNA样品。操作简便，效率高回收的DNA的大小有限制，不超过10kb，否则效率很低23第二节RNA的分离、检测和纯化在细胞中除了DNA外还有RNA,即rRNA、tRNA和mRNA。对于基因操作来说，涉及到的RNA主要是mRNA，而mRNA在细胞中的含量又是最少的。一个典型哺乳动物细胞约含10-5ugRNA，80-85%为rRNA（28S,18S和5S三种rRNA），15～20%主要由各种类型的低分子量RNA组成（如tRNA，核内小分子RNA等）mRNA为总RNA的1～5%mRNA是单链的，容易受到核酸酶的攻击，导致在RNA的操作过程中易被降解。因此，对RNA的操作要求比DNA的操作更严格，操作时必须设置专门的处理方法和程序。24一、注意事项---控制潜在的RNA酶的活性1．用具和溶液的去RNA酶处理RNA酶非常耐高温，即使高温灭菌也不可使其完全灭活，因此RNA酶在各种器物上的残留是不可忽视的。玻璃制品：180℃8hr或更长一次性使用的塑料制品：氯仿冲洗//专用溶液或用0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的水浸泡（37℃2hr）后再灭菌或购买无RNA酶污染的用具电泳槽：对于电泳用具最好使用专用的，不要用于其它分析，在使用之前用洗涤剂洗涮干净，再用3%H2O2和0.1%DEPC处理的水浸泡，清洗干净。溶液：用0.1%DEPC配制，注意有些药品不能用DEPC配制手套：保持干净、清洁252．RNA酶抑制剂的使用为了进一步防范RNA降解，一般在RNA样品和RNA反应中加入RNA酶抑制剂，现在应用较多的是蛋白类抑制剂，如人胎盘RNase抑制剂。除此之外，还有氧铜核糖核苷复合物（完全抑制剂，且抑制体外翻译）和硅藻土（吸附RNase吸附剂）。个人工作习惯和实验环境也很重要焦碳酸二乙酯（DEPC）是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris（三羟甲基氨基甲烷）和DTT的试剂不能用DEPC处理26二、RNA的抽提和纯化1．酚-异硫氢酸胍抽提法TRIZOL试剂是使用最广泛的抽提总RNA的专用试剂，由Gibco公司根据酚-异硫氢酸胍抽提法设计，主要由苯酚和异硫氢酸胍组成原理:异硫氢酸胍(GIT)与β－巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性；GIT与十二烷基肌氨酸钠（Sarcosyl）作用使蛋白质变性，从而释放RNA；酸性条件下DNA极少发生解离，同蛋白质一起变性被离心下来，RNA则溶于上清中。该法所提RNA纯度高完整性好较适合纯化mRNA，逆转录及构建cDNA文库，因此为大多数人采用。27二、RNA的抽提和纯化对任何生物材料的RNA提取步骤：①研磨组织或细胞，或使之裂解②加入TRIZOL试剂后，可保持RNA的完整，同时进一步破碎细胞并溶解细胞成分③加入氯仿抽提，离心，水相和有机相分离④收集含RNA的水相⑤通过异丙醇沉淀，可获得RNA样品。282．硅胶膜纯化法RNeasy试剂盒是由Qiagen公司设计，其设计思路与DNA的分离纯化思路相似，也就是含有目标核酸的细胞破碎液通过硅胶膜时，核酸吸附在硅胶膜上，从而与其它细胞成分分开，然后在低盐浓度下核酸可从硅胶膜上洗脱出