大肠埃希菌

张瑜敏标准号：GB-T5750.12-2006生活饮用水标准检验方法微生物指标标准来源：中华人名共和国国家标准应用范围：快速检测水样中的大肠菌群和大肠埃希氏菌查阅依据原理固定底物技术酶底物法（DefinedSubstrateTechnology）采用大肠菌群细菌能产生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase）分解ONPG（Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside）使培养液呈黄色，以及大肠埃希氏菌能产生β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase）分解MUG（4-methyl-umbelliferyl-β-D-glucuronide）使培养液在波长366nm紫外光下产生荧光的原理来判断水样中是否含有大肠菌群及大肠埃希氏菌。固定底物技术酶底物法可以选用国标中推荐粉状培养基，IDEXX公司的Coiliert试剂来进行简便的操作，无需确认试验。固定底物技术酶底物法检测时间短，只需24小时即可同时定量出水样中大肠菌群和大肠埃希氏菌的MPN值。检验程序供试液的制备取样准备结果报告实施操作制定工作计划表查阅依据接受指令操作步骤序号日期工作内容责任人1第一天1.接受指令,查阅依据,制定计划。2.备料,灭菌。3.取样,处理样品,接种检测。2第二天1.培养结果的观察,记录。2.填写原始记录,报告书等。工作进程计划表实施操作备料单定性反应备料10管法备料51孔定量盘法备料第一次培养基MMO-MUG培养基粉末MMO-MUG培养基粉末MMO-MUG培养基粉末仪器量筒100ml1个锥形瓶150ml1个高压真气灭菌器培养箱量筒100ml1个刻度吸管10ml1个锥形瓶150ml1个高压真气灭菌器培养箱量筒100ml1个锥形瓶150ml1个定量盘（51孔）1个高压真气灭菌器培养箱程控定量封口机注：若水样污染严重,可对水样进行稀释。需配置生理盐水（氯化钠8.5g加蒸馏水至1000ml，按比例配置）。若污染严重可增大稀释倍数。MMO-MUG培养基提供细菌生长所需营养及渗透压提供细菌生长所需营养及渗透压用来检测大肠菌群，使培养基呈现黄色用来检测大肠埃希菌，使培养基在紫外光下呈现蓝色荧光程控定量封口机定量盘（51孔）取样：检测所需水样为100ml。水样稀释（供试液的制备）：若水样污染严重,可对水样进行稀释。取水样10ml加入到90ml灭菌生理盐水中，必要时可加大稀释度。取样操作步骤用100ml的无菌稀释瓶（锥形瓶）量取100ml水样。加入2.7g±0.5gMMO-MUG培养基粉末,混摇均匀使之完全溶解后。放入36℃±1℃的培养箱内培养24h。定性反应①用100ml的无菌稀释瓶（锥形瓶）量取100ml水样。②加入2.7g±0.5gMMO-MUG培养基粉末,混摇均匀使之完全溶解后。③放入36℃±1℃的培养箱内培养24h。水样用100ml的无菌锥形瓶量取100ml水样。加入2.7g±0.5gMMO-MUG培养基粉末,混摇均匀使之完全溶解。准备10支15mm×10cm或适当大小的灭菌试管，用无菌吸管分别从前诉稀释瓶中吸取10ml水样至各试管中，放入36℃±1℃的培养箱中培养24h。10管法①用100ml的无菌锥形瓶量取100ml水样。②加入2.7g±0.5gMMO-MUG培养基粉末,混摇均匀使之完全溶解。③准备10支15mm×10cm或适当大小的灭菌试管，用无菌吸管分别从前诉稀释瓶中吸取10ml水样至各试管中，放入36℃±1℃的培养箱中培养24h。10ml水样水样用100ml的无菌锥形瓶量取100ml水样。加入2.7g±0.5gMMO-MUG培养基粉末,混摇均匀使之完全溶解。将上诉100ml水样全部倒入51孔无菌定量盘内，以手抚平定量盘背面以赶除孔穴内气泡，然后用程控定量封口机封口。放入36℃±1℃的培养箱中培养24h。51孔定量盘法用100ml的无菌锥形瓶量取100ml水样。加入2.7g±0.5gMMO-MUG培养基粉末,混摇均匀使之完全溶解。将上诉100ml水样全部倒入51孔无菌定量盘内，以手抚平定量盘背面以赶除孔穴内气泡，然后用程控定量封口机封口。放入36℃±1℃的培养箱中培养24h。水样10ml水样10管法结果判定固定底物技术酶底物法VS药典法相同点①实验原理相同，都是利用大肠埃希氏菌能产生β-葡萄糖醛酸酶分解MUG，使培养液在波长366nm紫外光下产生荧光的原理来判断水样中是否含有大肠埃希氏菌。不同点①需要的固定设备，耗材，操作步骤及人力不同。②固定底物技术酶底物法无需做阳性或阴性对照，药典法需要阳性和阴性对照。固定底物技术酶底物法优点①国标方法，结果准确可靠。假阳性假阴性率低。②24小时可检出两个指标，检测速度非常快③操作简便，手工操作时间短，只需2-3分钟④需要的固定设备，耗材及人力少，但效率高。⑤减少传统方法人为操作的误差，是应急突发事件的必备方法。缺点检测范围比较局限，一般只用于检测水样。固定底物技术酶底物法的应用2004年非典—此方法应用于中国CDC及上海CDC抗拒非典2008年奥运会—此方法应用于北京自来水及北京CDC的奥运安全供水任务。2008年汶川地震—此方法应用于四川省CDC及环境监测站中谢谢