第八章植物原生质体培养及细胞融合

33第八章原生质体培养与细胞融合第一节原生质体培养一、原生质体的培养概况1、概念：植物的原生质体(Protoplast)指除去细胞壁以后的裸露细胞。原生质体培养（Protoplastculture）是将游离的原生质体进行培养，通过细胞的分裂与分化，形成完整植株的过程。植物细胞壁上的DNA酶活性较高，当引入外源DNA时，细胞壁上核酸酶对该DNA破坏作用很大。原生质体培养可以避免细胞壁的阻隔，利于细胞器的移植或大分子物质的引入。原生质培养首先在烟草上获得成功Nagata&Takebe（1971），到1993有49个科，146个属的320多种植物培养成功，得到再生植株。2、意义1、可将外来遗传信息通过不同基因载体（噬菌体、细菌质粒）引入植物细胞，使细胞性状在分子水平上发生变化，再生出具有新性状的植物。2、通过异源原生质体融合，充分组合核质基因组，进行植物品种的改良,创建新品种及种质。3、以原生质体为材料，并进行体细胞遗传、远缘杂交不亲和机理等方面的研究。可进行细胞生物学、植物生理学、遗传学、分子生物学等方面的研究。二、原生质体的分离和纯化1原生质体的分离叶肉组织是制备原生质理想的材料，遗传性状一致。细胞壁主要成分是纤维素、半纤维素、果胶质等。分离原生质的方法主要有以下两种：（1）机械法：①首先将细胞放在高渗的糖溶液中（水势低），使细胞发生质壁分离（细胞失水），原生质体收缩成球状；②破碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。缺点：获得的原生质体少、产生的原生质体的细胞类型受到限制。最早在19世纪末，利用机械法分离藻类原生质。一般取材局限于具有液泡化程度较大的细胞或长形细胞的组织。但可避免酶制剂对原生质体的某些破坏作用。（2）酶解法采用多糖水解酶将细胞壁降解而获得原生质的一种方法。常用于降解细胞壁的酶有纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶（离析酶）、蜗牛酶、和胼胝质(pianzhi)酶等。1960年，cocking证实了用酶解法由高等植物细胞中大量分离原生质体的可能性。EA3—867纤维素酶，为中国上海植生所纤维素酶小组从野生型绿色木霉通过诱变处理获得的一个酶活性较高的突变菌株。日本R-10纤维素酶，使用于初生壁细胞。优点：可以获得大量的原生质体，适用于几乎所有植物和器官。缺点：酶制剂含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶及酚类物质，会影响原生质体的活力。2影响原生质体数量与活力的因素(1)细胞壁降解酶的种类和组合:一般植物细胞使用(纤维素酶0.7-1%,果胶酶0.5-1%),花粉细胞和四分体小孢子,可使用蜗牛酶和胼胝质酶。(2)渗透压的稳定剂种类:甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖等，如甘露醇一般为0.5-0.7M。(3)原生质膜稳定剂(CaCl2、0.1mM,葡聚糖硫酸钾0.2-0.3%)(4)pH影响5.4-6.03原生质体的纯化（净化）指将酶解后的溶液中的原生质体与组织残渣（如去未脱壁的细胞、细胞碎片）分开的过程。(1)沉降法原理：利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中进行过滤离心，使纯净完整的原生质体沉积于试管底部。首先将含有原生质体与酶混合液过网筛（44～169μm孔径），除去叶脉大组织块。然后低速离心（900～4500r/min）收集沉于底部的完整的原生质体。一般叶肉原生质体均采用沉降法，优点是采集方便，缺点是不能完全除去少量的细胞和破碎的原生质体。(2)悬浮法（漂浮法）原理：采用比重大于原生质体的高渗蔗糖溶液，离心后，使原生质体漂浮于溶液表面，而残渣碎屑沉淀于底部。加0.5M蔗糖溶液，原生质体浮于表面，取出浮于表面的原生质体，反复操作。这种方法可收集较纯的原生质体，原生质大小较一直，但获得原生质数量少，而且高渗溶液对原生质体有害，收集较沉降法困难。(3)界面法原理：利用两种比重不同的溶液，使完整的原生质体处于两液相的界面之中。在离心管中依次加入一层溶于培养基中的500mm/L蔗糖，一层溶于培养基中的140mm/L蔗糖和360mm/L山梨醇，最后一层加入悬浮于酶溶液中的原生质体（含有300mm/L山梨醇、100mm/LCaCl2）,轻轻混合，经5℃,400g条件下，离心5min，完整的原生质体悬浮在两层液体之间，叶绿体和破碎原生质体均在下面液体中，取出界面中的原生质体，按上述方法再重复进行一次。界面法的优点：可收集到较大的纯净的原生质体，同时避免收集过程中原生质体的破损。三、原生质体培养方法(1)固体培养法（平板法）：将原生质体均匀固定于琼脂培养基上进行培养的方法。首先把制备好的融化的琼脂培养基冷却至40℃，与等量原生质体悬浮液共同倒入培养皿中，迅速而微轻摇动，使原生质体均匀铺在琼脂之中。(2)液体培养法：液体培养法又分为浅层液体培养和悬滴法两种。浅层培养：将纯化后的原生质体悬浮液(3～5mL)直接放入培养皿内或三角瓶内进行培养。悬滴法：将原生质体悬浮液滴入培养皿盖上，每滴5～10μl，皿底放入保湿液，将盖密封培养。(3)双层培养法：将原生质体悬浮液，倒入已凝固的琼脂培养基上进行培养。液体培养与固体培养相结合，保持湿度较好，同时，培养过程中可定期添加培养基，因此，原生质体生长较快。四、原生质体培养的影响因素①原生质体的活力与起始密度②培养基成分③培养条件④不同植物与同种材料的不同基因型第二节体细胞杂交体细胞杂交（Somaticcellhybridization）：通过物理或化学的方法使原生质体融合，通过培养获得具有双亲遗传物质的后代。也叫做原生质体融合（protoplastfusion）。植物体细胞杂交的主要程序：①原生质体的制备②原生质体融合③杂种细胞的选择④杂种细胞的培养⑤杂种植株的鉴定一、原生质体融合自发融合:动植物细胞融合现象在自然界普遍存在。植物生殖过程的双受精，雄性生殖细胞与雌性卵细胞与中央细胞发生融合。在酶解法制备同源原生质体时，相邻细胞间发生融合。一般认为，这类融合与胞间连丝有关。诱导融合:指将原生质体分离出来以后，再加入诱导剂或其它方法促使两亲本原生质体融合。是依靠诱导剂，克服不同原生质体的排斥力使之彼此融合。1、物理方法利用离心、振动、电刺激等物理方法促使原生质体融合。电融合：1）微电极控制仪：两个微电极尖端，同时与两个靠近的原生质体表面接触，用5～12μA电波1～5ms（毫秒）。原生质体发生暂时收缩，引起了原生质膜状态暂时变化，从点连到面再到形成球形融合体约需要20～30min。2）平行电极：融合槽的两极通过交流电场产生电泳效应，电场产生的力作用于原生质体，使之偶极化，原生质体相互接触形成珍珠串。加适当强度的直流电脉冲，高强度的只需几个微秒就细胞膜发生可逆穿击而形成融合体。细胞融合仪Multiporator细胞先在交流电场中聚集，然后通过直流脉冲融合。特定的缓冲液体系可帮助完成高效的细胞电融合。神舟四号飞船上进行的太空细胞顺利融合，返回舱里的电融合仪内孕育出首批国产太空生命。2、化学方法：以不同的试剂为诱导剂，如各种盐类，多聚化合物，生物胶及其降解物等，促进原生质体融合。目前应用广泛的是Kao（1977）聚乙二醇（PEG）和高Ca2+法。原理：PEG和原生质体表面负电荷通过Ca连接下形成静电键，促进原生质体间黏着和结合；在高Ca和高pH溶液处理下，Ca和PEG分子被洗脱，导致电荷平衡失调而重新分配，使原生质体某些阳电荷和另一些原生质体阴电荷连接、吸附、聚合，最后融合在一起。PEG+高Ca2+-pH法：①将分离好的不同原生质体悬浮液作为供试材料。②配置适宜浓度的聚乙二醇（PEG）溶液与稀释清洗液。③原生质体的融合：混合等体积的两种原生质体悬浮液，加入PEG溶液并诱导两者接触、融合；用稀释清洗液冲洗（高Ca2+-pH法）。④培养：二、融合过程膜融合：生物膜融合是重要生物学现象，常态膜融合，内胞饮、外胞饮；非常态，如受化学的、物理的、生物的（噬菌体、病毒）等因素的刺激引起细胞病理状态的反应。从膜融合的过程来看，可以把膜融合的反应分成接触，诱导，融合，和稳定四个时期。而Ca2+、ATP、及ATP酶可调节膜融合的变化；质膜上磷脂状态的改变可以影响质膜构型和流动性的报道。核融合：有丝分裂核的融合，融合处理后形成了多核细胞，由于DNA合成不同步，不协调发生核分裂紊乱，形成多中心，核分裂而细胞质不分裂，核合并成块等异常现象，因此多核细胞难以成活。双亲进行同步分裂，形成共同纺锤体，染色体排列在分裂中期的赤道板上，再继续进行到分裂后期，这样所形成的融合核可继续分裂。三、融合细胞的筛选以X、Y分别代表两种植物的原生质体，当两者原生质体诱导融合后，原生质体群中，必然含有未融合的亲本原生质体（X和Y），同种融合体（XX，YY）以及异种融合体（XY）。1、互补筛选：有白化互补选择、生长互补选择、营养互补选择、基因互补选择、抗性互补选择等。Carlson(1972)光烟草和郎氏烟草双亲原生质体需要生长素,而杂种细胞在无生长素培养基上就可以生长。凡是在无生长素培养基上生长的细胞,就是杂种细胞。Gleimelius(1978),以两个烟草硝酸还原酶营养缺陷型突变体为杂交亲本，它们只能在有机氮或氨态氮培养基上生长，不能在硝酸盐培养基上生长，而杂种细胞由于在遗传上的互补，可以恢复硝酸还原酶活力，所以在硝酸盐培养基上生长的细胞即为杂种细胞。2、机械筛选：荧光染料标记：单标记、双标记用不同荧光染料标记两个亲本原生质体，在融合前用能发不同颜色荧光的荧光染料进行染色。在一个融合体中有两种荧光的细胞为异核体。异硫氰酸荧光素（FITC）绿色异硫氰酸罗丹明（RITC）红色四、杂种植株的鉴定1杂种植株和亲本植株的形态学特征2杂种和亲本的核型分析3同工酶谱分析过氧化物酶(POD)、超氧岐化酶（DOD）、脂酶、醇脱氢酶等RuBP羧化化酶：大亚基（LS）母性遗传，叶绿体DNA；小亚基（SS）孟德尔遗传，受核控制。4分子生物学方法分子生物学技术的发展，扩大了鉴定植物细胞杂种分析手段。应用最多是通过双亲及杂种的DNA限制性内切酶片段图谱(RFLP)。Dudirs(1979)得到胡萝卜×羊角芹的染色体数经检查2n=18，都是胡萝卜染色体，但用分子杂交方法证明带有羊角芹特有的RNA，确定是体细胞杂种。转Barnase基因植株的PCR检测1HaeIII/pBR322Marker；2阳性对照；3-7转基因材料PCR检测(限制性片段长度多态性,RFLP）1234567Southern杂交的鉴定转化有Barnase基因植株的Southernblotting分析1．阳性对照，2－5.转基因植株,6.阴性对照123456Melchers（1978）对野生番茄和马铃薯(2n=24)培养出杂种再生植株，进行了形态染色体和RUBP羧化酶谱分析，而RUBP羧化酶差异最明显。9株杂种中全都具双亲的RUBP小亚基，而其中5株只有马铃薯的大亚基，4株具番茄的大亚基，前者称Pomatoes(马－番杂种)，后者称Topatoes（番－马杂种）。属间杂交的先成功，是典型的核质遗传表型杂种.在理论在实践上都有较大价值。目前已再生植株的种内细胞杂种14个、种间62个，属间47个。野生芥×芥菜(Kirti,1995)，番茄×茄(Liu,1995)。Theprospectsofsuccesswiththegeneticmanipulationofplantshascreatedconsiderablepublicinterest.Melchersandhisco-workers(1978)producedahybridplantfromthefusionofpotatoandtomatoprotoplasts,allowingthetransferofgeneticinformationfromtwodifferentorganisms.Themethodprovidestheopportunityofproducinghybridsbetweenrelatedbutsexuallyincompatiblespecies.Melchers五、外源DNA的摄入1、以质粒或病毒为载体与DNA片段重组