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浅谈功能基因分析郭燕湿地工程技术研究所2014-08-03汇报内容已知功能基因12背景介绍3未知功能基因4讨论一背景介绍微生物功能基因组学研究包括微生物基因组内每个基因的作用或功能，以及基因的调节及表达，旨在从整个基因组及其全套蛋白质产物的结构、功能、机理的高度去了解微生物生命活动的全貌。在细菌基因组中，既有编码在极端环境下起催化作用酶的基因，也有编码分解化学污染物酶的基因，这些基因在真核细胞是不存在的。通过微生物功能基因组学研究，还能发现药物靶位和疫苗抗原。微生物基因的功能及表达研究结果也能为研究复杂生物的基因功能提供参考。由于微生物的种类繁多，功能基因组研究的内容较丰富。已有75种(株)微生物的基因组完成测序，160多种(株)微生物的基因组测序正在进行中。二已知功能基因的鉴定_以PQQ为例PQQ是一种氧化还原酶的辅酶，广泛分布于植物、动物、微生物及周围环境中，具有多种生物学功能。早在20世纪60年代，科学界开始对PQQ展开研究：先后在醋酸杆不动杆菌、荧光假单胞菌、欧文氏菌（Erwinia）等属中发现GDH含有一种相同的辅酶。它热稳定性好，能与亲核分子如氨基酸、巯基、氨等相互作用。应用光谱、质谱等技术，研究发现苹果酸脱氢酶、乙醇脱氢酶也有这种辅酶，晶体结构分析表明，该辅基是一个含有三个羧酸基团的醌类，确定其结构式为4,5-二氢-4,5-二氧-1氢-吡咯并（2,3-f）喹啉-2,7,9-三羧酸，命名为“吡咯喹啉醌”简称PQQ。PQQ只能在某些革兰氏阴性菌中合成，具有生物学功能如下：Ⅰ刺激细胞生长1.刺激微生物细胞生长：缩短菌体的迟缓期，类似菌体必需生长因子，随着浓度增长，加快菌体生长速度，提高菌体细胞产量；缩短菌体的迟缓期，不影响菌体细胞的生长速度。2.刺激植物细胞生长：刺激花粉萌发，其模式与刺激微生物生长的模式大致相同，即通过缩短生长停滞期以达到刺激植物生长的目的。•PQQ能够促进烟草种子萌发，提高脂肪酶活性和种子呼吸速率，还能够通过促进生长素和细胞分裂素合成，促进分子水平基因调控，从而提高植物细胞新陈代谢而发挥促进植物生长的作用。•在冬小麦花退化高峰的孕穗期和生长代谢旺盛期，喷洒PQQ可以提高叶片中叶绿素含量，加快植物的光合作用，提高谷丙转氨酶和硝酸还原酶的活性，从而调节植株体内生理代谢功能，有益于改善植株营养供给，减少穗部小花败育，提高麦穗结实率。•2008年，Choi等报道了一种植物根际促生长细菌(plantgrowthpromotingrhizobacteria，PGPR)PseudomonasfluorescensB16，该菌株为合成PQQ的野生型菌株，协和培养该菌与植物可以增加西红柿花数量、植株高度、果实数量和果实总重量，而所有不能合成PQQ的突变型菌株则没有此作用效果。因此，推测PQQ是PGPR发挥作用的重要原因之一。例子3.刺激人体细胞生长：Naito等报道低浓度PQQ(0.003～30μM)显著增强人成纤维细胞DNA的合成，并且显著增加细胞密度，相比之下，PQQ的刺激作用优于成纤维细胞生长因子和胰岛素等生长因子，与上皮细胞生长因子的作用相当；但当PQQ浓度达到750～1500μM时，DNA合成受到抑制引起细胞死亡。国内（熊顺华等）也先后报道了适量浓度的PQQ对大鼠皮质神经元和海马区神经元的生长速度有促进作用，但PQQ的浓度过高会产生毒性。ⅡPQQ是动物生长、发育和繁殖必需的营养因子•作为赖氨酰氧化酶的辅助因子：Kasahara和Kato在前人研究基础上，通过比对酵母、果蝇以及小鼠参与赖氨酸代谢通路的同源蛋白，间接地证明了小鼠体内的赖胺酰氧化酶是以PQQ作为辅助因子，建议将PQQ作为一种新的B族维生素。•然而，Felton、Anthony和Ｒucker分别发表文章否定了Kasahara和Kato得出的实验结论。Ｒucker等认为，从药理与营养学角度来分析，PQQ定义为一种维生素的证据还不足，只能说它是一种重要的生物因子。因为不同物种对于维生素的需求存在较大差异，例如，维生素C是人类、灵长类生物必需的，但是鼠却不需要。因此，对人类来说PQQ是否是一种维生素，需要进一步研究证实。ⅢPQQ对自由基有清除作用，可以保护机体减少氧化损伤•在正常生理条件下，生物体保持一种自稳态，自由基的产生和清除维持动态平衡状态，自由基产生过少或过多都会对机体健康产生影响。PQQ能够在没有谷胱甘肽(GSH)参与下直接清除过量的自由基。PQQ清除自由基的效力是抗坏血酸的50～100倍。如下3个方面：1.保护心脏免受氧化损伤：PQQ能够清除由缺氧再灌注产生的ROS(reactiveoxygenspecies），显著降低心脏中乳酸脱氢酶的释放，在黄素还原酶催化作用下，催化产物还能够降低血红蛋白过氧化状态，消除缺氧再灌注对心肌的损伤。Tao等报道，PQQ能够抑制H2O2诱导的大鼠心肌细胞ＲOS的产生、线粒体膜电位的降低，降低氧化应激、抑制线粒体功能的失活和保护大鼠心肌细胞等作用。2.防止眼晶状体损伤及肝脏脂质过氧化：白内障的发生与自由基水平升高有关。PQQ能够提高晶状体中GSH水平防止氧化应激对晶状体的损伤，保证晶状体代谢的正常进行，从而避免了因晶状体蛋白变性而发生的混浊，缓解白内障症状。同样的原理，PQQ可以通过提高肝脏中GSH水平，从而抑制肝脏内脂质过氧化发生，促进胆绿素通过胆小管向胆囊分泌，减少其在肝脏中的停留。3.抑制化学发光及炎症产生：化学发光是突发性氧化作用，PQQ通过抑制突发性氧化作用及诱发ＲOS的失活抑制化学发光的作用；PQQ亦可抑制炎症的产生，将鼠爪中注射角叉藻胶，可引起温度升高及局部水肿等炎症反应。如果先在小鼠腹腔注射PQQ，然后注射角叉藻胶，可明显发现局部水肿受到抑制，功效则与消炎痛(indomethacin)相当。4.抗氧化，保护肝脏损伤：PQQ对由某些肝细胞毒素造成的肝损伤具有保护作用，在大鼠实验中，如由硫代乙酰胺、四氯化碳、D－半乳糖胺等造成的肝损伤通过使用PQQ可显著降低肝脏血清胆红素、谷丙转氨酶的水平但不影响肝脏的重量。即使肝损伤已发生，PQQ的作用仍十分明显，健康大鼠的血糖、血尿氮等血、尿常规生化指标亦不受影响。330μM的GSH和21μM的维生素E的作用与3μM浓度PQQ的对肝脏的保护效果相同。5.PQQ发挥抗氧化作用的其他功效：乙醛是乙醇代谢的有害中间产物，也是乙醇中毒的重要原因。PQQ通过加快乙醛氧化的速度来降低乙醛的含量，进而降低小鼠乙醇中毒的危险。PQQ在保护植物方面同样有功效，在冷胁迫条件下，可以利用PQQ减缓过氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(AsAPOD)活性，促使GSH含量的下降，从而一定程度上减轻低温胁迫对黄瓜幼苗的伤害。Ⅳ提供神经营养和保护作用1.促进神经生长因子生成：PQQ能够促进许多细胞合成和分泌NGF，并且胞内的NGFmRNA浓度提高，PQQ在NGF转录前发挥促合成的作用。2.保护神经系统免受有害物质损伤：PQQ对由6-OHDA诱导构建的帕金森模型的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的具有神经毒性修复作用。PQQ在治疗中风方面亦具有潜在的应用价值，Jensen等对7日龄大鼠脑缺氧/缺血模型的研究报道，损伤前30min腹腔注射PQQ，可以显著减少脑梗死范围，并且不产生神经行为副作用。•PQQ作为一种具有优良性能的神经保护药物，在老年痴呆症、治疗帕金森症、中风等方面具有开发前景。小结•PQQ在自然界中广泛分布，它不仅参与氧化还原反应，同时还具有多种生物学功能，已有证据表明PQQ在增强动物免疫功能、提高繁殖力等方面发挥重要的作用。PQQ作为一种具有多种生理功能的生物活性物质，在炎症、溶血性贫血、传输神经兴奋失调、肝病和骨质疏松症等疾病的治疗方面具有很大的潜力，因此具有良好的药用开发前景。目前主要靠化学方法合成PQQ，其步骤繁杂，收率低，副产物多，后续处理困难，且成本高，产量低，价格昂贵，因此阐明其生物合成机理、研究PQQ的生物合成、构建高产菌株具有重要意义。•为提高PQQ产量，筛选和分离新型PQQ产生菌株将成为该领域重点研究的方向之一。•报道已知微生物菌属如Pseudomonas、Erwinia等属的一些菌株具有合成PQQ的基因。•PQQ、有机酸和解磷菌的解磷作用密切相关，P.fluorescensB16,thePQQ操纵子由11个基因组成,pqqA,-B,-C,-D,-E,-F,-H,-I,-J,-K,andpqqM.微生物功能基因序列分析方法分析方法——已知基因1拼接序列——SeqMan2翻译蛋白——MEGA设计引物-PCR扩增-测序3比对蛋白序列——NCBI4下载模式菌株Another——直接以核苷酸序列比对5比对建树——MEGAGY34DErwiniamallotivoraT（EXU75606）ErwiniaamylovoraT（WP004170874）GY35DGY32DGY33DPseudomonassynxanthaT（WP005792079）GY34CErwiniabillingiaeT（YP003743151）Pseudomonassp.（AEN80176）GY32CGY33CPseudomonassp.（WP007949605）100801458821009677100490.2利用SSCP技术分析甘蓝型油菜功能基因序列差异•李媛媛等利用DNA单链构象多态性(single-strandconformationpolymorphism,SSCP)技术,对10对功能基因特异性引物进行多态性分析,每对引物均检测到1个多态性位点。•结果表明,SSCP标记能够真实代表原始功能基因，甘蓝型油菜功能基因序列在不同材料间高度保守，其遗传变异类型主要来源于SNP。SSCP检测与分析•PCR产物最先在1.5%(W/V)的琼脂糖凝胶上检测,扩增带型明显,没有拖尾,并且比较明亮，就被用于SSCP分析。电泳时,温度控制在4℃左右,电压恒定在500V。电泳完成后,银染和显色；•回收片段及再扩增；•克隆片段的测序及其序列分析•SSCP分析：采用6%(W/V)的非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳，对上述10对引物的变性PCR扩增产物进行SSCP分析,每对引物PCR产物所形成的单链在甘蓝型油菜SI-1300和Eagle间均检测到1个清晰的多态性位点。•差异片段与原序列的比较分析随机挑选10个功能分子标记在非变性胶上的差异扩增产物,进行回收、克隆、测序,并利用NCBI网站提供的bl2seq软件,对目标片段与原始设计引物的序列进行比较。测序序列与所对应的基因原始序列之间相似程度平均高达98%，差异碱基数平均仅为2.3个，即SSCP标记对功能基因进行了真实扩增。•noue和Nishio对SCAR、CAPS和PCR-RF-SSCP技术在检测多态性效率方面的系统研究表明,9%的序列经SCAR检测有多态性,32%的序列经CAPS检测有多态性,而在经CAPS分析没发现多态性的序列中,又有52%的序列经SSCP检测表现多态性,充分证明SSCP检测技术的高效性。•鉴定未知基因的功能是一项复杂的工作,需要多种技术综合应用。•未知功能基因的鉴定方法可分为两大类：高通量的初步鉴定技术；另一类是系统分析技术。•高通量的鉴定方法主要是生物信息学技术、基因芯片技术和蛋白质组学技术等。•利用生物信息学技术研究未知功能的基因，主要依靠两个途径：一是在DNA层面上进行比较分析，根据该基因与已知功能基因的同源性,可以初步明确基因的功能；二是比较该基因编码产物(蛋白质)的序列和结构，对基因进行功能分类。克隆、突变体构建及表型分析等是鉴定未知功能基因的有效方法。基因芯片技术主要是通过检测环境因素对未知功能基因表达的影响，推测基因的可能功能。未知功能基因的鉴定THANKS!谢谢！