生物化学核酸

核酸是一类重要的生物大分子，担负着生命信息的储存与传递。核酸是现代生物化学、分子生物学的重要研究领域，是基因工程操作的核心分子。核酸概述第一节核酸是遗传物质的载体一、核酸的研究发现史1868年，F.Miescher从细胞核中分离得到一种酸性物质，即现在被称为核酸的物质。1944年，Avery的转换转化实验orand可分离1952年，Hexshey、ChaseT2噬菌体（捣碎器实验）1953年，Watson、CrickDNA双螺旋模型核酶（Ribozyme）98％核中（染色体中）真核线粒体（mDNA）核外叶绿体（ctDNA）DNA拟核原核核外：质粒（plasmid）病毒：DNA病毒二、核酸的种类和分布核酸分为两大类：脱氧核糖核酸DeoxyribonucleicAcid（DNA）核糖核酸RibonucleicAcid（RNA）RNA主要存在于细胞质中tRNArRNAmRNA其它RNA病毒：SARS三、分子生物学的中心法则第二节核酸的基本化学组成核酸核苷酸核苷磷酸碱基戊糖元素组成：CHONP核酸完全水解产生嘌呤和嘧啶等碱性物质、戊糖（核糖或脱氧核糖）和磷酸的混合物。核酸部分水解则产生核苷和核苷酸。每个核苷分子含一分子碱基和一分子戊糖，一分子核苷酸部分水解后除产生核苷外，还有一分子磷酸。核酸的各种水解产物可用层析或电泳等方法分离鉴定。组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为β-D-2-脱氧核糖；RNA所含的糖则为β-D-核糖。一、戊糖OHHOHHOHOHHHOCH2HOCH2OHHOHHHOHHD-核糖D-2-脱氧核糖RiboseDeoxyribose二、碱基1.嘌呤（Purine）123456978NNNHNNH2腺嘌呤AdenineANHNNHNONH2鸟嘌呤guanineG2.嘧啶（Pyrimidine）123456尿嘧啶uracilNHNHOOUNNHNH2O胞嘧啶cytosineCNHNHOO胸腺嘧啶thymineT核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱基的种类很多，大部分是上述碱基的甲基化产物。三、核苷（nucleoside）•核苷戊糖+碱基•糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键1’2’3’4’5’(OH)1’2’3’4’5’(OH)胞嘧啶核苷尿嘧啶核苷鸟嘌呤核苷腺嘌呤核苷NNOHHONNNH2HONNOHH2NNNNNNNNH2OHHOHHOHHHOCH2HOCH2OHHOHHOHHOHHOHHOHHHOCH2OHHOHHOHHHOCH2假尿苷（ψ）次黄苷（肌苷）I黄嘌呤核苷X二氢尿嘧啶核苷D取代核苷的表示方式7-甲基鸟苷m5G5OHAdenosineGuanosineCytidineUridine四、核苷酸（nucleotide）核苷酸核苷+磷酸戊糖+碱基+磷酸HHHHHHHHH五、核苷酸衍生物1.继续磷酸化O-POO-NNNNNH2OHHOHHOHHOCH2O-POO-O-POO-三磷酸腺苷(ATP)AMPADPATP2.环化磷酸化cAMPcGMP3.肌苷酸及鸟苷酸(强力味精)4.辅酶NAD、NADP、FMNIMPGMP六、多聚核苷酸（核酸）多聚核苷酸是通过一个核苷酸的C3’-OH与另一分子核苷酸的5’-磷酸基形成3’,5’-磷酸二酯键相连而成的链状聚合物。5’5’3’3’5′-磷酸端（常用5’-P表示）；3′-羟基端（常用3’-OH表示）多聚核苷酸链具有方向性，当表示一个多聚核苷酸链时，必须注明它的方向是5′→3′或是3′→5′。多聚核苷酸的表示方式DNARNA5′PdAPdCPdGPdTOH3′5′PAPCPGPUOH′或5′ACGTGCGT3′5′ACGUAUGU3′ACGTGCGTACGUAUGUT5’3’OHU5’3’OHOHOHOHOH第三节DNA的结构一、DNA的一级结构脱氧核糖核酸的排列顺序可以用碱基排列顺序表示连接键：3’，5’-磷酸二酯键磷酸与戊糖顺序相连形成主链骨架碱基形成侧链多核苷酸链均有5’-末端和3’-末端DNA的碱基顺序本身就是遗传信息存储的分子形式。生物界物种的多样性即寓于DNA分子中四种核苷酸千变万化的不同排列组合之中。2.基因与基因组基因（gene）：一段有功能的DNA片段，生物细胞中DNA分子的最小功能单位（交换单位）。蛋白质（mRNA蛋白质）产物tRNARNArRNA调节功能：调节基因无产物作用未知结构基因基因组（genome）：某生物体（完整单倍体）所含全部遗传物质的总和。包括：核基因组（拟核/核DNA）及核外（质粒/质体DNA）bp（碱基对）103104105106107108109101010111012人两栖类鱼类藻类酵母细菌E.Coli病毒质粒各种细胞、病毒和细菌质粒中基因组的大小3.原核生物基因组特点重复序列少，多位编码区多为操纵子形式组织有重叠基因存在4.真核生物基因组特点以染色体存在重复序列多基因组计划人类基因组计划（HumanGenomeProject，HGP）酵母基因组计划（YGP）大肠杆菌（E.Coli）二、DNA的二级结构DNA的双螺旋模型1953年，J.Watson和F.Crick在前人研究工作的基础上，根据DNA结晶的X-衍射图谱和分子模型，提出了著名的DNA双螺旋结构模型，并对模型的生物学意义作出了科学的解释和预测。在DNA分子中，嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等。DNA双螺旋模型要点B型结构两条链反向平行，右手螺旋碱基在内（A＝T，G≡C）碱基平面垂直于螺旋轴戊糖在外，双螺旋每转一周为10碱基对（bp）A型结构碱基平面倾斜20º，螺旋变粗变短，螺距2～3nm。Z型结构左手螺旋，只有小沟2.0nm小沟大沟双螺旋DNA的结构参数类型旋转方向螺旋直径（nm）螺距（nm）每转碱基对数目碱基对间垂直距离（nm）碱基对与水平面倾角A－DNAB－DNAZ－DNA右右左2.02.31.82.83.44.51110120.2550.340.2720º0º7º双螺旋稳定的力氢键碱基堆积力（疏水相互作用及范德华力）离子键等则DNA变性剂（热、pH、脲/酰胺、有机溶剂）DNA的存在形式二、DNA的三级结构DNA双螺旋的进一步扭曲构成三级结构，负超螺旋原核双链环状DNA（dcDNA）病毒单链环状DNA（scDNA）单链线性DNA（ssDNA）真核双链线性DNA（dsDNA）第四节RNA的结构与功能一、结构特点1.碱基组成A、G、C、U（A＝U/G≡C）稀有碱基较多，稳定性较差，易水解2.多为单链结构，少数局部形成螺旋3.分子较小4.分类mRNA（hnRNA核不均一RNA）tRNArRNA（snRNA/asRNA）少数RNA病毒二、tRNA占RNA总量的15％一种氨基酸对应最少一种RNA分子量25000左右，大约由70－90个核苷酸组成，沉降系数为4S左右。分子中含有较多的修饰成分。3'-末端都具有CpCpAOH的结构。tRNA的三级结构三、rRNA占RNA总量的80％原核生物真核生物核糖体rRNA核糖体rRNA30s70s50s16s5s、23s40s80s50s18s5s、5.8s、28s四、mRNA和hnRNA占细胞总RNA的3％～5％真核细胞mRNA的3‘-末端有一段长达200个核苷酸左右的聚腺苷酸(polyA)，称为“尾结构”，5’-末端有一个甲基化的鸟苷酸，称为”帽结构“。五、snRNA（smallnucleicRNA核小RNA）scRNA（smallcytoplasmicRNA）asRNA（antisenseRNA）第五节核酸的性质一、一般的理化性质两性解离/一般呈酸性（在中性溶液中带负电荷），微溶于水，不溶于有机溶剂线性大分子（粘度高。抗剪切力差）可用电泳或离子交换（色谱）进行分离室温条件下，DNA在碱中变性，但不水解，RNA水解加热条件下，D－核糖＋浓盐酸＋苔黑酚绿色D－2－脱氧核糖＋酸＋二苯胺蓝紫色二、核酸的紫外吸收特性在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。以A260/A280进行定性、定量DNA和RNA溶液中加入溴化乙锭（EB），在紫外下发出荧光三、核酸的变性、复性与分子杂交1.变性稳定核酸双螺旋次级键断裂，空间结构破坏，变成单链结构的过程。核酸的的一级结构(碱基顺序)保持不变。变性表征生物活性部分丧失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效应）变性因素pH（11.3或5.0）变性剂（脲、甲酰胺、甲醛）低离子强度加热DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，通常将紫外吸收的增加量达最大量一半时的温度称熔解温度，用Tm表示。一般DNA的Tm值在70-85C之间。DNA的Tm值与分子中的G和C的含量有关。G和C的含量高，Tm值高。因而测定Tm值，可反映DNA分子中G,C含量，可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.442.热变性和Tm3.核酸的复性变性核酸的互补链在适当的条件下，重新缔合成为双螺旋结构的过程称为复性。DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复，具有减色效应。将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。变性的DNA缓慢冷却时可复性，因此又称为“退火”。退火温度＝Tm－25℃复性影响因素片段浓度/片段大小/片段复杂性（重复序列数目）/溶液离子强度4.分子杂交DNA单链与在某些区域有互补序列的异源DNA单链或RNA链形成双螺旋结构的过程。这样形成的新分子称为杂交DNA分子。核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。Southern杂交（Southernbolting）Northern杂交（Northernbolting）Western杂交（Westernbolting）四、核酸的序列测定1.双脱氧链终止法（Sanger酶法）2.Gilbert化学降解法本章小结核酸是遗传物质载体的证明和研究历史核酸的化学结构：戊糖、碱基（A、T、G、C、U），核苷、核苷酸及其衍生物的结构特点（原子编号）DNA的结构：一级结构（核酸序列及其表示、基因及基因组、序列测定）、二级结构（Watson－Crick双螺旋模型、Z－DNA）、结构维持的化学键RNA结构与功能：碱基组成特点、RNA的种类结构及功能核酸的性质：酸碱性、变性与复性、分子杂交