pBR322这个名字的含义.

6.1CloningvectorsbasedonE.coliplasmidspBR322这个名字的含义:1.“p”说明它是一个质粒；2.“BR”表示最初构建它的实验室；3.“322”把该质粒和该实验室构建的其它质粒区分开。6.1.1Thenomenclatureofplasmidcloningvectors1.pBR322第一个优点是它的大小；2.拥有两套抗生素耐药性，而且每个抗性基因内部都拥有限制性单酶切位点；3.拥有相当高的拷贝数，(15或1000～3000个)。6.1.2TheusefulpropertiesofpBR3226.1.3ThepedigreeofpBR3226.1.4OthertypicalE.coliplasmidcloningvectorspBR327的特点：pBR327是从pBR322中移除一个长1089bp的片段构建的，仅改变了质粒的复制能力和接合能力。1.拷贝数比pBR322更高(30～45)；2.不具有自我转移能力(这一点对生物防范很重要)。pUC8的特点：pUC8来源于pBR322，仅保留复制起点和ampR携带lacZ′基因。1.拷贝数500～700；2.重组体识别仅需一步；3.拥有多克隆单酶切位点，而且与M13mp系列载体中的限制性酶切位点一样。6.1.4OthertypicalE.coliplasmidcloningvectors6.1.4OthertypicalE.coliplasmidcloningvectorspGEM3Z——克隆DNA的体外转录载体与pUC载体很相似，含ampR和lacZ′基因，在lacZ′基因内有一个限制性酶切位点。还有两个启动子——T7启动子和SP6启动子。噬菌体载体构建的困难：通常带有几个复制所必需的基因，可供改变的自由度很小。6.2CloningvectorsbasedonM13bacteriophage507bp可改变，还必须保证复制起点不被破坏。优点：可获得单链的被克隆DNA。6.2.1DevelopmentofthecloningvectorM13mp2含有对称克隆位点的M13mp7载体的构建如用EcoRⅠ、BamHⅠ、SalⅠ中的一种去酶解M13mp7，会出现什么情况？再加入外源DNA酶连会出现什么情况？含有对称克隆位点的M13mp7载体的构建M13mp7的多接头会被切下。再加入外源DNA会出现三种连接情况：1）插入了新的DNA；2）插入了多接头；3）载体自连。M13mp7的优点：无论新DNA是通过哪个酶切位点引入，都可通过EcoRⅠ从重组后的分子中切除。RecoveryofclonedDNAfromarecombinantM13mp7moleculebyrestrictionattheoutersitesofthepolylinker.M13mp8与M13mp9的多克隆位点顺序相反,在DNA测序中很重要。更复杂的M13载体6.2.2Hybridplasmid-M13vectors由于M13容纳的DNA片段非常有限，最大3kb，一般认为1500bp就是它的上限了。人们把M13基因组的一部分和质粒DNA结合在一起，构建了一种新型的载体，叫做噬菌体质粒（phagemid）。pEMBL8就是这样一个载体。6.3Cloningvectorsbasedonλbacteriophage天然λ噬菌体的不足：1.仅能增加3kb；2.限制性内切酶识别位点多个。6.3.1Segmentsoftheλgenomecanbedeletedwithoutimpairingviability15kb6.3.2Naturalselectioncanbeusedtoisolatemodifiedλthatlackcertainrestrictionsites6.3.3Insertionandreplacementvectors解决包装限制和多酶切位点问题后，就可以着手开发λ噬菌体的克隆载体了。最先产生的两类载体就是λ插入载体(insertion)和λ置换载体(placement)。插入载体可以插入超过8kb的外源DNA。外源DNA通过EcoRⅠ插入cⅠ基因，并使该基因失活，通过得到清晰噬菌斑检测。可以插入超过10kb的外源DNA。外源DNA通过含6个酶切位点的多接头插入lacZ′基因，并使该基因失活，通过得到无色噬菌斑检测。置换载体一个λ置换载体有被某种克隆所需限制性内切酶识别的两个位点，而在这两个位点之间的DNA片段将会被外源的DNA所置换。通常置换那段含多个酶切位点而被切成多段，故重新插入的概率很小。没重组的载体因为太小而不能被包装进λ噬菌体头部。置换载体可携带的DNA片段长度通常超过插入载体。λEMBL4可以携带超过20kb的外源DNA。填充物两端有成对的EcoRⅠ、BamHⅠ和SalⅠ酶切位点。重组体筛选可基于它的大小或Spi表型。λGEM11和λGEM12可以携带23kb的外源DNA。填充物两边各一个多接头含7个酶切位点，最外面还有SfiⅠ位点。重组体筛选可基于它的大小或Spi表型。6.3.4Cloningexperimentswithλinsertionorreplacementvectors1.限制性酶酶切载体加入新的DNA连接混合物产物分子转染大肠杆菌2.酶切λ线状分子加入新的DNA连接DNA与载体左右两个片段体外包装(只有正确连接的大小才适合)感染大肠杆菌6.3.5VerylargeDNAfragmentscanbeclonedusingacosmid黏性质粒(cosmid)：通过把λ噬菌体的cos位点插入质粒构成的克隆载体，用来克隆长度超过40kb的DNA片段。P3046.3.5VerylargeDNAfragmentscanbeclonedusingacosmid1.切开黏性质粒加入新DNA2.进行连接反应形成连环体3.体外包装4.感染大肠杆菌5.筛选培养什么样的菌落是重组体?6.4λandotherhighcapacityvectorsenablegenomiclibrariestobeconstructedM13载体可以携带不超过3kb的DNA片段，大多数质粒的携带量不超过8kb，而这个数字对像λEMBL4那样的置换载体能够达到20kb，对某些黏性质粒而言是40kb。基因组文库（genomiclibrary）：大量的克隆的集合，包含了某个生物体的所有基因。P3066.4λandotherhighcapacityvectorsenablegenomiclibrariestobeconstructed一个基因组文库到底需要多少个克隆N=N指克隆个数，P得到基因可能性，a插入载体中的DNA平均大小，b是基因组大小。)1ln()1ln(baP物种基因组大小/bp克隆数目17kb片段35kb片段大肠杆菌4.6×106820410酿酒酵母1.8×10732251500黑腹果蝇1.2×1082150010000稻米5.7×10810000049000人类3.2×109564000274000青蛙2.3×1010405300019690006.5Vectorsforotherbacteria