色氨酸(trp)操纵子

色氨酸（trp）操纵子lac和ara操纵子是编码分解代谢途径酶系的操纵子，负责碳源（例如乳糖和阿拉伯糖等）的分解利用，这些操纵子的表达受相应碳源的诱导。在细菌中还有负责一些物质合成代谢的操纵子，例如色氨酸操纵子（tryptophanoperon,trpoperon）就是负责色氨酸合成的操纵子。trp操纵子是由一个启动子和一个操纵基因区组成，该操纵基因区控制一个编码色氨酸生物合成需要的5种蛋白的多顺反子mRNA的表达。由于trp体系参与生物合成而不是降解，它不受葡萄糖或cAMP-CRP的调控。色氨酸的合成主要分5步完成，有7个基因参与整个合成过程。trpE和trpG编码邻氨基苯甲酸合酶，trpD编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶，trpF编码异构酶，trpC编码吲哚甘油磷酸合酶，trpA和trpB则分别编码色氨酸合酶的α和β亚基。trpE基因是第一个被翻译的基因，和trpE紧邻的是启动子区和操纵区。另外，前导区和弱化子区分别定名为trpL和trpa（不是trpA）。trp操纵子中产生阻遏物的基因是trpR，该基因距trp基因簇很远。后者位于大肠杆菌染色体图上25分钟处，而前者则位于90分钟处。在位于65分钟处还有一个trpS（色氨酸tRNA合成酶），它与携带有色氨酸的tRNATrp共同参与trp操纵子的调控作用。弱化子在trpmRNA5'端trpE基因的起始密码前有一个长162bp的mRNA片段被称为前导区，其中123～150位碱基序列如果缺失，trp基因表达可提高6-10倍，而且无论是在阻遏细胞内还是在永久性突变的细胞内都是这样。当mRNA合成起始以后，除非培养基中完全没有色氨酸，转录总是在这个区域终止，产生一个仅有140个核苷酸的RNA分子，终止trp基因转录，这就是123～150区序列缺失会提高trp基因表达的原因。因为转录终止发生在这一区域，并且这种终止是被调节的，这个区域就被称为弱化子。研究引起终止的mRNA碱基序列，发现该区mRNA通过自我配对可以形成茎-环结构，有典型的终止子特点。前导肽实验表明衰减作用需要负载tRNATrp参与，这意味着前导序列的某些部分被翻译了。分析前导序列发现，它包括起始密码子AUG和终止密码子UGA；如果翻译起始于AUG，应该产生一个含有14个氨基酸的多肽。这个假设的多肽（还未实际观察到）被称为前导肽。前导序列具有一个非常有意义的特点，在其第10和第11位上有相邻的两个色氨酸密码子。这一点很重要，因为组氨酸操纵子中，也具有弱化子，也具有一个类似的能编码前导肽的碱基序列，此序列中含有7个相邻的组氨酸密码子。苯丙氨酸操纵子中同样存在弱化子结构，其前导序列中也有7个苯丙氨酸密码子。这些密码子参与了trp及其他操纵子中的转录弱化机制。mRNA前导区的序列分析trp前导区的碱基序列已经全部测定，引人注目的是其中4个分别以1、2、3和4表示的片段能以两种不同的方式进行碱基配对（图6-22），有时以1-2和3-4配对，有时只以2-3方式互补配对。RNaseT1降解实验（此酶不能水解配对的RNA）表明，纯化的trp前导序列中确有1-2和3-4的配对方式，由此定位的3-4配对区正好位于终止密码子的识别区，当这个区域发生破坏自我配对的碱基突变时有利于转录的继续进行。转录弱化作用转录的弱化理论认为mRNA转录的终止是通过前导肽基因的翻译来调节的。因为在前导肽基因中有两个相邻的色氨酸密码子，所以这个前导肽的翻译必定对tRNATrp的浓度敏感。当培养基中色氨酸的浓度很低时，负载有色氨酸的tRNATrp也就少，这样翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度就会很慢，当4区被转录完成时，核糖体才进行到1区（或停留在两个相邻的trp密码子处），这时的前导区结构是2-3配对，不形成3-4配对的终止结构，所以转录可继续进行，直到将trp操纵子中的结构基因全部转录。而当培养基中色氨酸浓度高时，核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子，在4区被转录之前，核糖体就到达2区，这样使2-3不能配对，3-4区可以自由配对形成茎-环状终止子结构，转录停止，trp操纵子中的结构基因被关闭而不再合成色氨酸（图6-24）。所以，弱化子对RNA聚合酶的影响依赖于前导肽翻译中核糖体所处的位置。ThetrpoperonisnegativelyregulatedbytheTrprepressorTrprepressorbindsitstargetDNAsequenceonlywhenititselfisboundbyitsco-repressor,tryptophan.ThetrpoperatorisapalindromicDNAsequencetrp操纵子转录的调控是通过Trp阻遏物实现的，它结合于trp操纵基因序列，但Trp阻遏物的DNA结合活性直接受色氨酸调控，色氨酸结合Trp阻遏物，并起着一个效应分子的作用（也称之辅阻遏物）。在有高浓度色氨酸存在时，Trp阻遏物-色氨酸复合物形成一个同源二聚体，并且紧密结合于trp操纵基因序列，因此可以阻止转录。然而当色氨酸水平低时，缺少色氨酸的Trp阻遏物以一种非活性形式存在，不能结合DNA。在这样的条件下，trp操纵子被RNA聚合酶转录，同时色氨酸生物合成途径被激活。trp操纵子的另一种转录调控是称之衰减作用（attenuation）的调控机制，这是一种将翻译与转录联系在一起的新的转录调控形式。细胞内Trp-tRNATrp浓度决定核糖体是否停留在trpmRNA中的前导序列内的两个连续的色氨酸密码子处。当色氨酸水平高和Trp-tRNATrp可利用时，起转录终止作用的发卡环结构（由区3和区4之间）形成，RNA聚合酶刚好在一个聚尿嘧啶的下游处脱离DNA模板，转录终止。当由于细胞内色氨酸有限，Trp-tRNATrp水平低时，核糖体就停留在RNA中连续的一对色氨酸密码子处。核糖体这一瞬间的停留给出时间使得一种替换的发卡结构在新的RNA中（由区2和区3之间）形成，是一种抗终止的RNA结构，它破坏了转录终止信号，使得RNA聚合酶能够继续沿着DNA模板滑动完成转录。ThetrpoperonP=promoterT=terminatorO=operatortrpRtrpAPOPTTPolycistronicmRNA(encodes5proteins)mRNATrpR(repressor)5separateproteinsthatweresynthesizedfromonemRNAtrpBtrpCtrpDtrpEAttenuatorTrpRAttenuationinthetrpoperonEffectivelyaddsafinetuningtotheregulationofthetrpoperon.Severalkeypoints:1.Transcription&translationaretightlycoupledinbacteria(attenuationrequiresthis).2.SynthesisofaleadersequencerichinTrpinfluenceswhethertranscriptionofthetrpoperoniscomplete.3.If[Trp]isadequatetranscriptionisterminatedbeforethetrpoperon.4.If[Trp]isinadequatetranscriptioniscompleted.5.TerminationoftranscriptionisdeterminedbyleadermRNAsequence.Attenuation–atranscriptionalformofcontrolmRNAleadersequenceAttenuator110140trpELeaderpolypeptide14aawith2Trpaa1162TypicalstemloopofTerminationsiteAttenuation12344231mRNATrpcodonsmRNAsections1basepairswith23basepairswith4ONLY3+4generatetheterminationsiteAttenuation–Inadequate[Trp]1234mRNATrpcodons2314Ribosomestallsduetolow[Trp]Thislargestemloopof2+3doesNOTactasaterminator.Transcriptioncontinues!!RNApolymeraseAttenuation–Adequate[Trp]1234431RibosomemovesRapidlyalongmRNAmRNAsections3basepairswith4toformaterminationsite,suchthatRNApolymeraseprematurelyfallsoffthemRNAandabortsfurthertranscription.mRNAAttenuationworksbyhavetheRNApolymerasestop(terminate)beforethetranscriptionofthestructuralgenes,butAFTERithasalreadystartedtomakeanRNA.ThekeyistheregionoftheoperoncalledtrpL(seethefiguresabove).ThetrpoperonofE.coliIntryptophan-poormediumIntryptophan-richmediumOperonSummaryWehaveconsideredindetailthreeoperons:thelacoperon,thearaoperon,andthetrpoperon.Thefirsttwoareoperonsconcernedwiththecontrolofcatabolicprocesses(utilizationofenergysubstrates)whilethethirdisconcernedwithanabolicprocesses(synthesisofamoleculethecellneeds).Allthreesharenegativecontrolfeatures,usingrepressorproteinsbindingtooperatorstoplacetheoperonintheoffstate.Thefirsttwohavepositivecontrolfeaturesthatincreasetranscriptioninresponsetolowglucose(CAP-cAMPbindingtotheCAPsite).Thisisnotthecaseforthetryptophanoperon.Thetryptophanoperon,however,hastheadditionalnegativecontrolfeatureofattenuation.Thesefeaturesaresummarizedinthefollowingtable:consensusTATA(Pribnow)boxE.coliPromotersAllostericEffectorsBindingcanalsoberequiredforbindingofrepressor(e.g.Trp)orcanblockanactivator.GenomicOrganizationoftheTrpOperonTheTrpOperonNotethattheorderofthegenesfollowstheorderofthebiosyntheticpathway!!ControlofGeneExpressionintheTrpOperon1)Theenzymecatalyzingthef