结核分枝杆菌与实验室生物安全

结核分枝杆菌与实验室生物安全广东检验检疫技术中心BSL-3实验室师永霞一、实验室感染典型案例二、结核杆菌的生物安全防护三、生物安全柜的安全使用四、意外事故处理3一、实验室感染典型案例1.中国CDCSARS感染事件说明：•2004年4月，安徽、北京发现新的SARS病例，其中两名CDC实验室人员。事件原因：•采用未经论证确实有效的SARS灭活方法；•在不符合防护要求之实验室内操作SARS。42.新加坡SARS感染事件说明：•2003年8月23日某国立大学博士研究生从事西尼罗研究，感染SARS病患检体；事件原因：•实验室安全程序不当，同一时间进行不同活性病毒研究，造成其交叉感染；•对于人员生物安全教育训练不足，人员对所有病原体警觉性不够，无自我监测症状观念。5•3.台湾SARS感染事件说明：•2003年12月，某研究所研究人员感染SARS。为清理运输舱内溢出物，仅作一般消毒，穿戴一般防护装备，将头与躯干伸入运输舱中清理。事件原因：•未使用适当除污程序；•未使用合适消毒剂；•未报告所有溢出意外。4.结核杆菌感染1事件说明：•1952年，细菌学家两年从事B族结核杆菌工作；•血清1:160稀释度下凝集，无典型症状；•1955年，右手红色伤口（丘疹），右腋下轻微痛感（结节）；•创伤物质培养处B族结核杆菌；事件原因：•防护措施不到位；•个人防护装备不全；•实验人员安全意识不强。5.结核杆菌感染2事件说明：•戴一次性乳胶手套在安全柜准备操作鉴定结核分枝杆菌；•操作时，左手桡骨背侧被安全柜的前窗边缘划伤，皮肤上有小的擦伤；•停止工作，70%酒精清洗伤口；•3周后，出现局部红肿，有无痛的硬结；•在伤口处取标本进行培养，6周后培养阳性；•限制性片段多态性分析，与操作的结核杆菌一致；事件原因：•意外事故—皮肤损伤；•虽抗结核治疗，但证实实验室感染；•意外事故感染预案—做好评估、处理和监测。8实验室生物安全：•指实验室的生物安全条件和状态不低于容许水平，可避免实验室人员、来访人员、社区及环境受到不可接受的损害，符合相关法规、标准等对实验室生物安全责任的要求。实验室获得性感染：•人类感染病原微生物源自于实验室或实验室相关活动，不论其表现为有症状或无症状，都属于实验室获得性感染。二、结核杆菌的生物安全防护9实验室生物风险管理要素10设施设备标准操作程序个人防护装备管理实验室生物安全控制要素防护屏障（一）设施设备和个人防护装备•一级防护屏障实验室的生物安全柜和个人防护装备等构成的防护屏障。•二级防护屏障实验室的设施结构和通风系统等构成的防护屏障。12一级防护屏障生物安全柜是最重要的安全设备，形成最主要的防护屏障；为消除或减少人员暴露于有害生物材料所配备其他安全设备（如离心机负压罩等）；必须给实验室工作人员配备必要的个体防护用品：手套、口罩、鞋套、面罩、正压服等。13各类口罩：需做个体适配性试验医用外科口罩杯罩式随弃口罩折叠式随弃口罩个体安全防护措施14手套穿脱:戴前检漏、盖住衣袖15脱隔离衣程序手部表面消毒后由内向外翻卷脱去外层手套注意退出胳膊时让隔离衣内面朝外向中间覆盖，两手持领、将隔离衣清洁面在外向内翻卷，投入污物袋中。16二级防护屏障选址与平面布局；围护结构；送、排风系统；消毒、灭菌设备；污水处理设备；尸体处理设备；其他安全装置。17BSL-2结构设计常规要求①实验室有带锁的门；②有洗手水槽；③工作面易于清洁；④天棚不渗水；⑤实验室台结实；⑥按照要求放置生物安全柜；⑦适当的照明系统；⑧眼睛冲洗装置；⑨实验室排除的气体不能循环到非实验区；⑩窗户安装有纱窗。18①生物安全柜②高压灭菌器③洗眼装置BSL-2设备条件在BSL-1设备条件上增加：实验室位置：与公共场所分隔开；通风:有方向性。19实验室入口处贴上生物安全标志，注明实验室生物安全级别，负责人姓名，负责人姓名和电话，需要接种的免疫种类，进入实验室的特殊要求等；•正在进行感染性试验时禁止他人进入，或经负责人同意后进行安全防护后进入；（二）实验室管理要素20•工作人员接受必要的免疫接种，免疫耐受或正在进行免疫抑制剂治疗的病人须经同意方可进入工作；必要时留本底血清；•新员工必须接受培训方可进入工作，老员工必须接受再培训；•尽量减少利器使用，严格按照规范操作；•消毒物品需放在容器内运输、进行有效灭菌消毒和效果监测，交给有资质单位进行处理；•建立实验室感染应急预案、意外事故报告、登记制度；•实验室人员：①注意潜在的危害；②熟知操作规程，精通操作技术。（三）标准操作程序《人间传染的病原微生物名录》：•结核分枝杆菌危害程度第二类，高致病性病原微生物；•少量细菌的分离培养、样品检测和药敏实验在BSL-2实验室进行；•大量细菌培养在BSL-3实验室，动物感染实验在ABSL-3实验室；•无感染性材料的操作在BSL-1实验室。22•结核病传播途径可由呼吸道、消化道、皮肤等途径感染，但其主要传播途径是以空气为传播因子的呼吸道传染，而排菌的肺结核病人传染性更大，是传播感染的主要传染源。•实验室感染以气溶胶形式的呼吸道感染和皮肤感染。23产生气溶胶的操作及预防•1.接种：应使用无弹力的铂丝接种环，结核菌接种后接种环火焰灭菌易崩散，酒精灯烧灼时要特别注意。2.混匀：吸管吸吹菌液时不要产生气泡，应沿容器壁排出。3.研磨：最好使用组织研磨器，乳钵易产生气溶胶。254.移液：吸管上端的棉花松紧要适度，吸液时要从管底吸取，吹出时要轻缓，不要全部吹净，以免产生气泡，形成气溶胶。123××5.开封和开启安瓿管：要避免压力和气流的急剧变化。6.离心：离心管套底垫要完好，使用匹配的管、套、离心头，加盖。√×××7.注射：做好个人防护，正确使用注射器，使用后不能套回。1234•8.容器和运送：采样管外旋盖，密闭；室内运送样本要避免滑落，移出室外要有坚实密闭的外包装。31三、生物安全柜的安全使用分级：•I级生物安全柜：保护工作人员和环境。•II级生物安全柜：保护工作人员、环境和样品。•III级生物安全柜：采用手套箱更严格地保护工作人员、环境和样品。32II级生物安全柜•可开启前窗；•从前开口向内的气流用于保护人员；•经HEPA过滤后向下送的层流，以保护样品；•排出的气体采用HEPA过滤器过滤则用于保护环境；•表面风速在75-100fpm；•适用于要求生物安全等级为1-3的工作。33II级生物安全柜的分类II级A1型生物安全柜：70%柜内循环，30%空气排出，工作窗口流速75fpm；II级A2型生物安全柜：70%柜内循环，30%空气排出（套管），工作窗口流速100fpm；II级B1型生物安全柜：30%柜内循环，70%空气排出（套管）,工作窗口流速100fpm；II级B2型生物安全柜：100%空气排出室外（硬管）,工作窗口流速100fpm。34II级A2型生物安全柜•从操作口向内气流的最小平均速度应保持100ft/min（0.5m/s）；•经HEPA过滤器过滤的下送气流，是来自于同一个压力排风系统的下送气流和操作口向内气流的混合气体的一部分；•经HEPA过滤器过滤后的空气可以排回实验室或通过排风罩排入环境。35II级A2型生物安全柜TypeA2不带排风管路最小表面风速100fpm满足生物安全等级1、2、3的要求不涉及放射性物质不涉及挥发性有害化学品建议不应有明火36Ⅱ级B2型生物安全柜（称为“全排型”）•从操作口向内气流的最小平均速度应保持100ft/min（0.5m/s）；•经HEPA过滤器过滤的下送气流来自于实验室或室外的空气（亦即安全柜中排出的气体不再循环用作下送气流）；•操作口向内气流和下送气流经HEPA过滤器过滤后全部排入大气，不再循环送入安全柜或送回实验室；•所有污染的风道和压力排风系统均保持负压，或由直接排出的（不再循环经过工作区）负压风道和压力排风系统包围。37满足生物安全等级1、2、3的要求适用于放射性物质*适用于挥发性有害化学品*建议不应有明火全排风适用于进行含有挥发性有毒化学物质和放射性核素的微生物学研究工作Ⅱ级B2型生物安全柜38只有鼓风机开着和气流指示在安全的位置时，才能使用BSC；如果BSC有一扇可开的玻璃面板，当工作时，它必须限制在固定的位置和高度；生物安全柜使用注意事项39操作前应将本次操作所需的全部物品移入安全柜，避免双臂频繁穿过气幕破坏气流；安全柜内不放与本次实验无关的物品。柜内物品摆放应做到清洁区、半污染区与污染区基本分开，操作过程中物品取用方便，且三区之间无交叉。物品应尽量靠后放置，但不得挡住气道口，以免干扰气流正常流动；干净的物品被污染的区域废弃物托盘垃圾袋40打开风机5～10分钟，待柜内空气净化并气流稳定后再进行实验操作。将双臂缓缓伸入安全柜内，至少静止1分钟，使柜内气流稳定后再进行操作；操作时应按照从清洁区到污染区进行，以避免交叉污染。为防可能溅出的液滴，可在台面上铺一用消毒剂浸泡过的毛巾或纱布，但不能覆盖住安全柜格栅；操作期间，严禁使用酒精灯等明火，以避免产生的热量产生气流，干扰柜内气流稳定；且明火可能损坏HEPA滤器；工作时尽量减少背后人员走动以及快速开关房门，以防止安全柜内气流不稳定；在实验操作时，不可打开玻璃视窗，应保证操作者脸部在工作窗口之上。在柜内操作时动作应轻柔、舒缓，防止影响柜内气流。工作结束之后，所有装置和容器在移出BSC之前应对其表面消毒。在进行这一操作的过程中BSC鼓风机应保持运转；BSC中工作结束后进行清场消毒，完毕后至少应在五分钟内保持BSC鼓风机运转，同时打开紫外灯，照射10-15分钟。（在紫外灭菌时要关闭通风；紫外光对人体有损害，注意个人保护。）安全柜应定期进行检测与保养，以保证其正常工作。工作中一旦发现安全柜工作异常，应立即停止工作，采取相应处理措施，并通知相关人员。（1.新II级生物安全柜放到指定位置后；2.II级生物安全柜被移动位置后；3.对II级生物安全柜进行检修后；4.II级生物安全柜更换高效过滤器后；5.II级生物安全柜定期常规现场检测，每年一次。）123456789101112结核杆菌适宜的消毒灭菌措施湿热：60℃30分钟、70℃10分钟、80℃5分钟和90℃1分钟，煮沸与高压灭菌；紫外：10～1mg/ml菌悬液、液层厚度3mm，用10W紫外线灯在距离0.5m处持续照射3分钟，在距离1m处持续照射10分钟，经培养无细菌生长。但紫外线穿透力弱，难以透入固体物质内部和液体深层，因此紫外线通常用于空气和物体表面消毒。乙醇：直接接触70%～75%乙醇5～30分钟可被杀死，因此可用于皮肤消毒。但由于乙醇能凝固蛋白，使痰表面形成一层把菌体包裹起来的膜，短时间内不能杀死细菌，故乙醇不能用于痰的消毒。•“84”消毒液：0.5%“84”消毒液15分钟可杀死结核分枝杆菌培养物，但对痰液中的结核分枝杆菌几乎无消毒效果。•苯酚：2%苯酚5分钟、5%苯酚1分钟能杀死结核分枝杆菌培养物。5%苯酚与痰液等量混合，24小时才能杀死结核分枝杆菌。•煤酚皂：0.5%煤酚皂60分钟，1%煤酚皂45分钟，2%煤酚皂10分钟，5%煤酚皂5分钟，即能杀死结核分枝杆菌培养物。5%～10%煤酚皂等量混入痰标本，12小时可杀灭结核分枝杆菌。结核杆菌适宜的消毒灭菌措施四、意外事故处理意外事故生物性化学性物理性天然灾害火灾感染性生物材料、传染病病人样本强酸、强碱等噪音、辐射等水灾、地震等48•溢出（生物安全柜内溢出、实验室内溢出）•离心过程离心管破裂（密闭性和非密闭性离心桶）•生物安全柜电力中断•皮肤、粘膜污染•针刺、割伤•……生物性意外类型49（一）处理程序1.实验室内溢出/溢洒•大量液体形成不规则水渍；•部分飞溅；•小部分形成空气播散的气溶胶颗粒。大的气溶胶颗粒很快就会沉降，但较小的气溶胶颗粒则会在空气中停留较长时间，并可经通风系统离开溢洒区域。当发生液体溢洒时，应考虑有气溶胶产生。50（1）准备溢洒处理工具包明确标示出溢洒处理工具包的存放地点。基础的溢洒处理工具包通常包括：•对感染性物质有效的消毒