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基因工程表达系统和蛋白质工程中国药科大学生物制药教研室一、外源基因在大肠杆菌中的表达1.大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征a大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架基因克隆表达系统成熟完善繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物b大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多的内毒素外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理启动子终止子核糖体结合位点密码子质粒拷贝数转录翻译Ptac=3Ptrp=11Plac启动子-35区序列-10区序列PlacTTTACATATAATPtrpTTGACATTAACTPtacTTGACATATAATPtraATAGACATAATGTPlLTTGACAGATACTPrecATTGATATATAAT启动子转录调控机理具有多顺反子结构，基因排列次序为：启动子（lacP）-操纵基因（lacO）-结构基因（lacZ-lacY-lacA）正调节因子CAP负调节因子lacI启动子Lac表达系统以大肠杆菌lac操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统lacIPlaclacOlacZlacYlacA高效转录cAMPCAPlacIPlaclacOlacZlacYlacARNA聚合酶基底水平转录Lac表达系统正调节因子CAPcAMP激活CAP，CAP–cAMP复合物与lac操纵子上专一位点结合后，能促进RNA聚合酶与–35、–10序列的结合，进而促进Plac介导的转录。RNA聚合酶RNA聚合酶基因工程中使用的lac启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即PlacUV5cAMP葡萄糖代谢cAMP浓度降低cAMPCAPCAPLac表达系统lacUV5突变体PlacUV5突变体能够在没有CAP存在的情形下非常有效的起始转录，受它控制的基因在转录水平上只受lacI的调控，因此用它构建的表达载体在使用时比野生型Plac更易操作。Lac表达系统负调节因子lacI在无诱导物情形下，lacI基因产物形成四聚体阻遏蛋白，与启动子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。lacIPlaclacOlacZlacYlacARNA聚合酶基底水平转录lacIPlaclacOlacZlacYlacA高效转录RNA聚合酶IPTGmRNATac表达系统tac启动子是由trp的–35序列和lacUV5的–10序列拼接而成的杂合启动子。调控模式与lacUV5相似，但mRNA转录水平更高于trp和lacUV5启动子（Ptac=3Ptrp=11Plac），因此在要求有较高基因表达水平的情况下，选用tac启动子比用lacUV5启动子更优越。启动子-35区序列-10区序列PlacTTTACATATAATPtrpTTGACATTAACTPtacTTGACATATAATlac、tac启动子对宿主菌的要求在普通大肠杆菌中，LacI阻遏蛋白仅能满足细胞染色体上lac操纵子转录调控的需要。当多拷贝的lacO随着带有lacUV5、tac启动子的表达质粒转化进入大肠杆菌后，LacI阻遏蛋白与lacO的比例显著下降，无法保证每一个lacO都能获得足够的LacI阻遏蛋白参与转录调控。表现为在无诱导物存在的情形下，lacUV5、tac启动子有较高的本底转录。lac、tac启动子对宿主菌的要求为了使以Lac、Tac表达系统具有严紧调控外源基因转录的能力，一种能产生过量的LacI阻遏蛋白的lacI基因的突变体lacIq被应用于表达系统。大肠杆菌JM109等菌株的基因型均为lacIq，常被选用为Lac、Tac表达系统的宿主菌。但是这些菌株也只能对低拷贝的表达载体实现严紧调控，在使用高拷贝复制子构建表达载体时，仍能观察到较高水平的本底转录。需在表达载体中插入lacIq基因以保证有较多的LacI阻遏蛋白产生。lac、tac表达系统存在的问题IPTG用于诱导lac、tac启动子的转录，但由于IPTG本身具有一定的毒性。从安全角度，对表达和制备用于医疗目的的重组蛋白并不适合。一些国家规定在生产人用重组蛋白质的生产工艺中不能使用IPTG解决方法lac和tac启动子的转录受温度严紧调控乳糖替代IPTG诱导lac和tac启动子的转录lac、tac表达系统存在的问题lac和tac启动子的转录受温度严紧调控把阻遏蛋白LacI的温度敏感突变体lacI(ts)、lacIq(ts)插入表达载体或整合到染色体后，均能使lac和tac启动子的转录受到温度严紧调控在较低温度（30℃）时抑制，在较高温度（42℃）时开放。用乳糖替代IPTG诱导lac和tac启动子的转录乳糖在b-半乳糖苷酶作用下生成异乳糖，异乳糖具有诱导剂的作用这一过程涉及乳糖的转运和转化，其效率受到多种因素的影响和制约因此乳糖诱导的有效剂量大大高于IPTG。乳糖本身作为一种碳源可以被大肠杆菌代谢利用，较多的乳糖存在也会导致菌体生理及生长特性变化。乳糖替代lPTG作为诱导剂的研究要与发酵工艺结合起来，才能显示其良好的前景。转录调控机理色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底状态。在培养系统中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的细菌培养体系中，除去色氨酸是困难的，因此基因工程中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目的基因表达启动子Trp表达系统以大肠杆菌trp操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统Trp表达系统PtrpOtrpRNA聚合酶基底水平转录高效转录mRNAPtrpOtrp去除色氨酸高效转录mRNAPtrpOtrp加入IAARNA聚合酶RNA聚合酶PL和PR表达系统以l噬菌体早期转录启动子PL、PR为核心构建的表达系统在野生型l噬菌体中，PL、PR启动子转录与否决定了l噬菌体进入裂解循环还是溶源循环。启动子PL和PR表达系统转录调控的机理由l噬菌体PE启动子控制的cI基因的产物是PL、PR启动子转录的阻遏物。cI基因的产物在大肠杆菌宿主中的浓度取决于一系列宿主与噬菌体因子之间的错综复杂的平衡关系。由于通过细胞因子来控制cI基因产物的产生和消失是相当困难的。因此PL、PR表达系统都选用温度敏感突变体cI857(ts)的基因产物来调控PL、PR启动子的转录。在较低温度（30℃）时以活性形式存在在较高温度（42℃）时失活脱落PL和PR表达系统宿主菌中没有cI基因产物，PL、PR启动子的高强度直接转录，带有PL或PR启动子的表达载体在普通大肠杆菌中相当不稳定。对宿主菌的要求用溶源化l噬菌体的大肠杆菌作PL、PR启动子表达载体的宿主菌N4830-1，POP2136等菌株已经溶源化cI857(ts)l噬菌体，可用作表达外源基因时的宿主菌。把cI857(ts)基因组装在表达载体上宿主菌选择范围更大PL和PR表达系统存在的问题由于PL和PR表达系统诱导时不加化学诱导剂，成本又低廉，最初几个在大肠杆菌中制备的药用重组蛋白质都采用PL或PR表达系统。缺陷在热脉冲诱导过程中，大肠杆菌热休克蛋白的表达也会被激活，其中一些是蛋白水解酶，有可能降解所表达的重组蛋白。在大体积发酵培养菌体时，通过热平衡交换方式把培养温度从30℃提高到42℃需要较长的时间，这种缓慢的升温方式影响诱导效果，对重组蛋白表达量有一定的影响。T7表达系统大肠杆菌T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。T7噬菌体基因1编码的T7RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。T7RNA聚合酶活性高，其合成RNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。在细胞中存在T7RNA聚合酶和T7噬茵体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系，最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录达到很高的水平。T7表达系统转录调控的机理T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7RNA聚合酶，因此T7RNA聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。化学诱导型温度诱导型双质粒系统T7RNA聚合酶T7启动子目的基因T7RNA聚合酶基因？启动子化学诱导型噬菌体DE3是l噬菌体的衍生株，一段含有lacI、lacUV5启动子和T7RNA聚合酶基因的DNA片段被插入其int基因中用噬菌体DE3的溶源菌作为表达载体的宿主菌，调控方式为化学诱导型，类似于Lac表达系统。T7RNA聚合酶基因lac启动子E.Coli（DE3）T7启动子目的基因T7RNA聚合酶IPTG诱导温度诱导型PL启动子控制T7RNA聚合酶基因，通过热诱导方式激发T7噬菌体启动子的转录。这种方式可以使本底转录降到很低的水平，尤其适用于表达对大肠杆菌宿主有毒性的重组蛋白质。T7RNA聚合酶基因PL启动子E.Coli（CE6）T7启动子目的基因T7RNA聚合酶热诱导cI857双质粒系统一个质粒带有T7RNA聚合酶基因，另一个质粒带有T7启动子和目的基因两个质粒的复制子和抗性标记不能相同调控方式为控制T7RNA聚合酶的启动子调控类型T7RNA聚合酶热诱导T7启动子目的基因T7RNA聚合酶基因PL启动子cI857p15AoriKanRColE1oriAmpRT7表达系统存在的问题T7表达系统表达目的基因的水平是目前所有表达系统中最高的，但也不可避免出现在相对较高的本底转录，如果目的基因产物对大肠杆菌宿主有毒性，会影响细胞的生长。解决办法之一在表达系统中低水平表达T7溶菌酶基因。因为T7溶菌酶除了作用于大肠杆菌细胞壁上肽聚糖外，还能与T7RNA聚合酶结合抑制其转录的活性。目前T7溶菌酶基因都通过共转化质拉导入表达系统，它能明显降低本底转录，但对诱导后目的基因的表达水平无明显影响。强化转录终止的必要性外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下：转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降；如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率终止子强终止子的选择与使用目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tf。对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5‘端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）核糖体结合位点大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：位于翻译起始密码子上游的6–8个核苷酸序列5’UAAGGAGG3’即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16SrRNA3’端区域3’AUUCCUCC5’并与之专一性结合将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译；翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始位点，有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成基因编码区5’端若干密码子的碱基序列核糖体结合位点对外源基因表达的影响SD序列的影响一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于SD（UAAGGAGG）序列与16SrRNA的碱基互补性，其中以G