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某种生物（所有或部分DNA)限制酶多个DNA片段多个重组DNA受体菌的不同个体分别导入DNA连接酶载体群体（基因组或部分基因文库）（不同个体含不同DNA片段）（同种限制酶切割）1.从基因组文库中提取目的基因目的基因的制备：PCR技术DNA复制过程DNA变性（90～95℃）→退火（复性55~60℃）→子链延伸（70~75℃）→重复循环DNA复制起始，RNA引物形成→DNA片段生成→RNA引物水解→完整的DNA分子形成相同点原则碱基互补配对条件模板、原料（dCTP、dATP、dGTP、dTTP）、能量、酶、引物等不同点解旋方式氢键在高温下断裂，双链全部解开解旋酶催化氢键逐步断裂场所体外主要在细胞核中引物DNARNA酶热稳定DNA聚合酶（Taq酶）解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等结果在短时间内形成大量的DNA片段形成完整的DNA分子2.利用PCR技术扩增目的基因(1)反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。目的基因的mRNA杂交双链(单链RNA/单链DNA)单链DNA反转录酶DNA聚合酶双链DNA(目的基因)3、人工合成目的基因（DNA合成仪）已知核苷酸序列，且基因较小，也可通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。(2)根据已知的氨基酸序列合成DNA法：根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成蛋白质的氨基酸排列顺序可以用测序仪自动完成。如何构建？导入的方法？如何检测？进行细胞培养1.基因工程流程图：（重组DNA分子导入农杆菌，再让农杆菌感染植物细胞）1.目的基因导入植物细胞农杆菌转化法：基因枪法：花粉管通道法双子叶+裸子植物单子叶生出转基因动物基因表达载体显微注射仪注入受精卵早期胚胎移植输卵管或子宫中发育发育大肠杆菌Ca2+处理感受态细胞（易吸收DNA的生理状态）基因表达载体缓冲液转基因生物适宜温度混合培养3.目的基因导入微生物细胞2、目的基因导入动物细胞（常用受精卵）2.蛋白质工程流程图：蛋白质三维结构氨基酸序列多肽链基因DNA预期功能DNA合成分子设计mRNA生物功能转录翻译折叠光下培养愈伤组织胚状体或丛芽植物体脱分化再分化离体的植物组织或细胞发育避光培养1、植物组织培养技术注意技术的原理、培养的条件、特点、优点。营养、激素营养、激素杂种植株融合的原生质体AB再生出细胞壁脱分化愈伤组织再分化2.植物体细胞杂交技术1.植物细胞的融合2.植物组织培养植物细胞A原生质体B原生质体A杂种细胞AB去壁人工诱导融合完成的标志植物细胞B去壁--酶解法融合内容：膜、质、核的融合。物理法化学法（筛选出杂种细胞）融合原理：膜的流动性；动物胚胎或幼龄动物的组织、器官胰蛋白酶处理剪刀剪碎单个细胞加培养液制成细胞悬浮液不死细胞原理：细胞增值无限传代作用：去掉组织间蛋白质思考:动物细胞培养最终能培养成生物体?1.动物细胞培养培养过程：不能部分细胞遗传物质改变原代培养随细胞数增多，细胞分裂贴壁生长到表面相互接触时就会停止分裂增殖——细胞接触抑制传代培养动物细胞培养条件1、无菌、无毒的环境:（添加一定量的抗生素，定期更换培养液.）2、营养:（葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、维生素、动物血清等。）3、温度和PH:36.5+（-）0.5度,7.2-7.44、气体环境（注意作用）O2和CO2（95%空气和5%CO2）O2是细胞代谢的需要，CO2是维持培养液的PH值某种生物（供体）MⅡ期的卵母细胞体细胞细胞质细胞核早期胚胎卵裂重组细胞体细胞核移植细胞培养受体（代孕）母体子宫胚胎移植与供体生物遗传物质相同的个体分娩妊娠2.克隆动物产生的过程：不同DNA的两个细胞A和B灭火的病毒等融合的细胞（两个核）杂交细胞（单个核）有丝分裂3.动物细胞融合杂交细胞的特点是什么？杂交细胞灭活的病毒等手段小鼠骨髓瘤细胞B淋巴细胞经免疫的小鼠提取杂交瘤细胞第一次筛选用特定的选择性培养基第二次筛选能产生特定抗体、培养条件下能无限增殖的杂交瘤细胞体外培养注射到小鼠腹腔提取单克隆抗体克隆化培养和抗体检测4.单克隆抗体的制备比较项目植物组织培养动物细胞培养原理细胞的全能性细胞增殖培养基性质固体培养基液体培养基培养基特有成分蔗糖植物激素葡萄糖动物血清培养结果植物体细胞株、细胞系培养目的快速繁殖、培育无病毒植株获得细胞或细胞分泌蛋白1、植物组织培养与动物细胞培养的比较2、植物体细胞杂交与动物细胞融合的区别主要用于制备单克隆抗体获得杂种植株用途物理、化学方法（同左）灭活的病毒物理（离心、振荡、电刺激）化学（聚乙二醇）诱导方法使细胞分散后诱导细胞融合去除细胞壁后诱导原生质体融合细胞融合的过程细胞膜的流动性细胞膜的流动性、植物细胞全能性细胞融合的原理动物细胞融合植物体细胞杂交比较项目精子、卵子发生的比较项目精子发生卵子发生区别场所睾丸的曲细精管（唯一场所）卵巢（MI）、输卵管（MII）（场所不唯一）时间初情期开始到生殖机能衰退性别分化后开始，卵泡的形成和在卵巢内的储备，是在出生前（胎儿期）完成的，减数第二次分裂是在精子和卵子的结合过程中（受精过程）完成的过程特点1.MI和MII是连续的，需变形2.细胞质均等分配1、MI和MII是不连续的，不需变形2、细胞质不均等分配结果形成4个精细胞形成1个卵细胞和3个极体（极体将来退化）相同点1.原始生殖细胞的增殖为有丝分裂2.生殖细胞的成熟为减数分裂3.成熟过程均经一次复制和两次分裂，子细胞中染色体数目减半胚胎移植采集卵母细胞体外培养采集精子体外获能体外受精早期胚胎培养受体牛（时期：）1）超数排卵（试剂）2）活体取卵（仪器）3）从屠宰的卵巢取卵方法①②③（方法，试剂）（试剂）（培养条件、目的阶段）成熟的卵子获能的精子MII中期方法胚胎工程选择供体母牛受体母牛……同期发情处理……超数排卵供体公牛配种冲卵质量检查、培养胚胎移植妊娠检查分娩（胚胎移植的犊牛）胚胎移植的基本程序：同期发情技术：主要是借助外源激素剌激卵巢，使其按照预定的要求发生变化，使处理母畜的卵巢生理机能都处于相同阶段，从而达到同期发情。有性生殖无性生殖核移植技术、胚胎移植遵循不遵循体外受精胚胎移植试管动物克隆动物生殖方式技术手段遗传物质遗传规律比较试管动物和克隆动物来自2个个体主要来自核供体