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基因编辑技术CRISPR-Cas9背景介绍:无论研究什么生物现象，都需要做一件事：1）Lossfunction:降低基因或删除基因2）Givefunction:提高基因的表达3）Mutationknockin:定点突变改变基因同源重组：一般物种几率低，10-6难！RNAiKnockdown:不完全敲除背景介绍:ZFNs和TALENs：设计、合成、验证-----难！！！蛋白识别DNA序列+DNA内切酶CRISPR/Cas系统:•CRISPR(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat)序列和Cas(CRISPR-associated)蛋白系统是很多细菌和大部分古生菌的天然获得性免疫系统，以防止病毒和质粒入侵。CRISPR/Cas9技术:•CRISPR-Cas9技术来源于是II型CRISPR-Cas系统：DNA识别结构：RNA二聚体（tracrRNA:crRNA）核酸内切酶：Cas9sgRNA•CRISPR-Cas9技术的设计和实现简单，使得世界各地的实验室都可以快速地将其引入生物学研究中。CRISPR/Cas9前景:完美基因靶向操作：识别特异DNA序列+操作DNA的酶划时代的基因靶向操作技术！！！使基因靶向操作更加捷易！！！基因组水平药筛动物模型CRISPR/Cas9能做什么?1.工程细胞和生物模型•应用于研究基因组的重组和癌症或其它疾病的发生发展。•在哺乳动物细胞中系统研究基因功能。（AgenomescalelentiviralsgRNAlibrarywasdevelopedtogenerateapooledloss-of-functiongeneticscreeningapproachsuitableforbothpositiveandnegativeselection.）•CRISPRinterference(CRISPRi)–KRAB•CRISPRactivation(CRISPRa)–VP64•CRISPRlabeling(CRISPR-l)–EGFP2.拓展研究CRISPR/Cas9systemofRNA-guidedgenomeeditingisrevolutionizinggeneticsresearchinawidespectrumoforganisms.3.CRISPR/Cas9基因敲除•TraditionalKO•ConditionalKO–LoxP/loxP-Cre–Knockin（敲入）–Pointmutation（点突变）3.CRISPR/Cas9基因敲除3.CRISPR/Cas9基因敲除4.Cas9与传统基因打靶时间对比传统基因打靶CRISPR/Cas9打靶载体构建4月载体构建及sgRNA和Cas9mRNA体外转录2周ES细胞打靶筛选6月（无）嵌合体小鼠构建4月F0代杂合子(B6)4月IVF及F0代(C57)生产及鉴定2月总计约1.5年约2-3月MetabolismmodelBrainModel5.案例11.Realtimepositionofprotein！2.Nogoodantibody？---Cas9help！5.案例2ConditionalGeneKnockout1.解决致死型基因的研究难点2.特定组织器官或发育过程中基因功能的研究3.基因敲除的可调控性5.案例3RecoveryorConstructionofdiseasemodelincellline•Pointmutation•Multi-genemutation•Largefragmentdeletion•LargefragmentinsertionEngineeringinEmbryoorGermCells5.案例4半年的研究成果！物种及敲除类型敲除基因数小鼠基因敲除11种基因小鼠基因修饰8种基因大鼠基因敲除3种基因雪貂基因敲除5种基因人iPS\ES细胞1疾病基因修复、1疾病造模Conclusions:Faster,Better,Cheaper捷易的优势——减少off-targetCas9D10A突变体DNA切口酶捷易的优势——无基因组整合1）Cas9mRNA和sgRNA电转2）单链DNA做Doner3）Cas9蛋白和sgRNA电转服务项目价格周期Cas9基因敲除小鼠4.8万元2~6个月Cas9条件性敲除小鼠10万元6~12个月Cas9基因敲除细胞系3.5万元2~4个月报价Thanksforyourattention!!!