基因引物设计

常用实验技术简介黄雪娜2011-8-4目录全长cDNA克隆引物设计染色体步移技术全长cDNA克隆是许多后续更深入实验的基础；真核生物mRNA的特征及转录过程的了解；全长cDNA克隆方法：灵活掌握；同源克隆技术RACE-PCR技术基因克隆前的准备工作看有没有被别人克隆出来；查看文献了解基因的功能及表达特征；了解该基因可能涉及的工作（如激酶活性的测定及DNA-蛋白相互作用等），制定计划；了解相近物种该基因的信息，以利于扩增过程中预测PCR的延伸时间；同源片段的克隆本实验室的EST数据库；NCBI数据库；RT-PCR用兼并引物扩增同源片段；设计兼并引物是重点！！！！！注意事项：高质量的mRNA和高效率的逆转录；加大引物浓度；选择mRNA表达量高的组织做模板；梯度PCR或者降落PCR；巢氏PCR;序列分析；3’RACE:原理：5’RACE原理：注意事项：RNA的完整性；高效的逆转录酶；多次5’RACE相结合；应用丰度高的组织做模板；长片段扩增应用LA-Taq酶；同源克隆方法；用随机引物或者OligoT引导逆转录；序列分析引物设计：Primer5.0；一般的序列处理：DNAStar中的Editseq；序列拼接：DNAStar中的Seqman、BL2；序列在线比对：NCBI-BLAST()；序列多重比对：Bioedit、ClustalW2()；寻找ORF:Editseq、ORFFinder()；序列作图：Bioedit、EMBOSS()；构建进化树:MEGA4.1；蛋白结构域分析：SMART()；蛋白理化性质分析及二、三级结构分析：EXPASY()、Psipred()；信号肽分析：SignalP()；磷酸化位点分析：NetPhos2.0Server()；糖基化位点：NetNGlyc1.0Server()；引物设计兼并引物RACE引物荧光定量引物染色体步移引物原核表达用引物PCR-SSCP引物总原则①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。②产物不能形成二级结构。③引物长度一般在15~30碱基之间。④G+C含量在40%~60%之间。⑤碱基要随机分布。⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。⑧引物5′端可以修饰。⑨引物3′端不可修饰。⑩引物3′端要避开密码子的第3位。兼并引物兼并碱基：M=A/CR=A/GW=A/TS=G/CY=C/TK=G/TV=A/G/CH=A/G/TD=A/G/TB=G/C/TN=A/G/C/T简并度：兼并引物设计步骤利用ncbi搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或cDNA编码的氨基酸序列对所找到的序列进行多序列比对确定合适的保守区域设计兼并引物（软件或者人工）选择合适的序列进行多重比对；选择高度保守的序列作为引物；人工设计时要注意引物序列是和原序列相同还是反向互补的；简并度不能太高，可用次黄嘌呤代替N；引物的3‘端残基尽可能使用确定残基；降落PCR;巢氏PCR;RACE引物各3条重叠的引物，引物之间最好距离100-200bp；若同源片段长度太短，可先做3’RACE，再做5’RACE；尽量靠近cDNA末端（3’RACE-3’末端；5’RACE-5’末端）；荧光定量引物纯化方式：PAGE；产物长度：80-150bp；TM值:58-62;在编码区内靠近3’末端处设计；高的特异性：测序及熔解曲线分析；染色体步移引物以DNA为模板设计引物；3条重叠引物；高的退火温度：高于60度；原核表达用引物会读表达载体图谱；去除信号肽序列；根据目的表达序列直接取相应序列作为引物，注意要不要加终止密码子；在引物的5’末端加酶切位点和相应的保护碱基，注意方向；选酶切位点：选择常用的内切酶，并看这两种酶是否可以在统一体系中进行双酶切；PCR-SSCP引物PCR产物长度：150-400bp；高的特异性；染色体步移克隆启动子Tail-PCR预测启动子位置将启动子序列克隆进一个无其他启动子，且报告基因为荧光素酶的载体中转染细胞系荧光素酶活性的测定确定启动子活性的强弱谢谢！