第三章 目的基因的克隆与基因组文库的建立

第三章目的基因的克隆与基因文库的构建第一节、基因克隆基因克隆？基因克隆；经无性繁殖获得基因许多相同基因拷贝的过程抽取DNA切下鼠DNA切开质粒DNA将质粒导入宿主细胞混合、连接培养基中加抗生素培养裂解细胞释放DNA分子杂交分离扩增目的克隆目的基因基因载体重组体分切接转筛表总体技术路线基因工程的基本操作步骤•1、目的基因的取得•2、载体的选择•3、目的基因与载体DNA的体外重组•4、重组载体引入受体细胞•5、表达筛选基因载体目的基因质粒噬菌体病毒PCRcDNA人工合成基因文库限制性内切酶有切口的载体有切口的目的基因DNA连接酶重组体转化转染体外包装带重组体的宿主细胞表型筛选电泳法核酸杂交免疫学方法目的基因的表达基因克隆与基因表达产物有何不同？（一）DNA片段的获得•1、从基因所在的生物体直接取得•限制性内切酶（restrictionenzymes）•2、人工合成DNA片段（DNA合成仪）•3、PCR反应合成DNA•4、mRNA反转录成cDNA•5、用机械的方法•超声波、M123Kb.23.19.46.54.32.32.0图3不同酶切时间电泳图MλHindⅢmarkers1酶切10分钟2酶切20分钟3酶切5分钟回收2-7KbDNA理想载体的基本条件：可转移性合适的复制位点多克隆位点：广泛、特异选择标志，便于筛选和鉴定分子较小，可容纳较大的外源DNA(二）、载体的选择载体的种类：1、质粒载体2、入噬菌体载体3、柯斯质粒载体4、M13噬菌体载体5、真核细胞的克隆载体：酶母质粒载体、病毒载体6、人工染色体限制性内切酶酶切切酶切（三）、目的基因与载体DNA的体外重组用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片断接到载体上，形成DNA重组分子；接磷酸二酯键的形成DNA连接酶DNA连接酶DNA连接酶目的基因与载体的连接（四）、重组载体引入受体细胞•重组载体引入受体细胞，使基因扩增和表达出供体基因所提供的部分遗传性状。重组体的转化受体细胞转JM109感受态含氨苄平板Am重组质粒感受态转化方法CaCl2诱导转化电穿孔PEG介导转化人工体外包装特殊处理受体细胞细胞膜特性改变CaCl2处理受体细菌50-100mmol/LCaCl2感受态细菌重组体转入细菌基因重组转染体外包装噬菌体噬菌体体外包装含氨苄平板连接目的基因基因载体连接酶转化（五）重组体克隆的筛选与鉴定筛宿主细胞转化后的克隆群体：1遗传检测法1）抗药性标志的选择pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板2）α互补（ß-半乳糖苷酶法）lacZAmN2H片段COOH片段X-galLacZ蓝色化合物X-gal（LacZ基因N端序列）插入片段（LacZ基因失活）LacZ基因N端序列LacZ酶2电泳检测法凝胶电泳检测加样孔DNAMarker空质粒重组质粒重组质粒酶切重组质粒的PCR扩增片段原位杂交3菌落杂交筛选法4免疫化学检测法放射性抗体检测法滤膜（固定抗体）+5DNA序列检测ACTGAAGGCT•第二节基因文库的建立•真核生物基因组DNA十分庞大，其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右，而且含有大量的重复序列。采用电泳分离和杂交的方法，都难以直接分离到目的基因。•在生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNA文库一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA文库等。很显然，cDNA文库的信息量远小于基因组文库•。基因文库(genelibrary)指某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外通过重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有菌落或噬菌体的集合。按照外源DNA片段的来源，可将基因文库分为：•基因组文库(genomiclibrary)（含有全部基因）•cDNA文库(complementaryDNAlibrary)（含有全部蛋白质编码的结构基因）基因文库的完备性代表性和随机性代表性是指文库中所有克隆所携带的DNA片段重新组合起来可以覆盖整个基因组，即可以从该文库中分离任何一段DNA。代表性是衡量文库质量的一个很重要的指标。在文库的构建过程中引用了两个策略，一是采用部分酶切或随机切割的方法来消化染色体DNA，以保证克隆的随机性，保证每段DNA在文库中出现的频率均等；二是提高文库所含基因组DNA的总容量，通常用覆盖基因组的倍数来衡量。为预测一个完整基因组文库应包含克隆的数目，Clark和Carbon于1975年提出如下的计算公式：N=ln(1–P)/ln(1–f)N：代表一个完全基因组文库所应该包含的重组克隆个数P=任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率f=克隆片段的平均大小/生物基因组的大小例如，人的单倍体DNA总长为2.9x109bp，基因文库中克隆片段的平均大小为15kb，则构建一个完备性为0.9的基因文库至少需要45万个克隆；而当完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要180万个克隆基因文库的质量标准除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大以减轻筛选工作的压力载体的装载量最好大于基因的长度避免基因被分隔克隆克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域以利克隆排序克隆片段易于从载体分子上完整卸下重组克隆能稳定保存、扩增、筛选一、基因组DNA文库1.基因组DNA文库：指将某生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，与合适的载体体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。2、目的：a）分离有用的目的基因b）保存某种生物的全部基因3、相对于cDNA文库，基因组文库的优点：cDNA克隆只能反映着mRNA的分子结构，没有包括基因组的间隔序列。cDNA文库中，不同克隆的分布状态总是反映着mRNA的分布状态，即：高丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较高，分离基因容易；低丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较低，分离基因困难；从cDNA克隆中，不能克隆到基因组DNA中的非转录区段的序列，不能用于研究基因编码区外侧的调控序列的结构与功能。基因组文库cDNA文库信息供体DNAmRNA载体噬菌体，黏粒，人工染色体质粒，噬菌体连接前部分酶切，分级分离反转录合成cDNA双链连接粘端连接，人工接头同聚物加尾，人工接头筛选核酸探针核酸探针，免疫探针基因组文库和cDNA文库的比较4.基因文库的构建流程组织可克隆之DNA载体DNAcDNAmRNA部分酶解DNADNA长度分级双链cDNADNA与载体连接引入宿主细胞鉴定文库的完备性扩增后供长期储存筛选出所需要的克隆基因组文库的构建流程•①载体的选择和制备；•②高纯度、大分子量基因组DNA的提取；•③基因组DNA的部分酶切与分级分离；•④载体与DNA片段的连接；•⑤转化或侵染宿主细胞。基因组DNA文库限制性内切酶基因组DNA基因重组转化细菌体外包装①载体和受体的选择出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的l-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体由于绝大多数真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文库构建的载体通常选质粒或l-DNA上述几种载体的最大装载量如下：质粒15kbl-DNA25kbCosmid45kbBAC300kbYAC400kb载体的制备要求两点，一是纯度高；二是去磷酸化好。用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌②基因组DNA的制备•为了最大限度保证基因在克隆过程中的完整性，DNA在分离纯化操作中应避免过度的断裂。制备的DNA分子量越大，文库的重组率和完备性也就越高。•一般所提取的DNA分子量至少应该是文库最终平均插入片段长度的3～5倍。•实践表明，提取的基因组DNA分子量越大，所得到的重组克隆的插入片段越大。•用常规方法制备的染色体•DNA的长度一般在100kb左右•如果先将细胞固定在低融点凝胶中，然后置入含有SDS、蛋白酶K、RNaseA的缓冲液中浸泡，可获得100kb大小的DNA片段•③基因组DNA的切割一般采用超声波处理和限制性内切酶部分酶切,其目的是：•第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区第二，保证DNA片段大小均一•超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头•部分酶切法一般选用4碱基识别序列的限制性内切酶，如：SauⅢA或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控,•连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体！！！•④载体与DNA片段的连接•在基因组文库的构建过程中，大量体系连接前先使用小体系连接来寻找最佳比例！•方法一：粘末端连接•方法二：人工接头法⑤文库的连接转化或包装侵染在基因组文库的构建过程中，最好选择转化效率高的进口感受态细胞和质量稳定的进口包装蛋白！研究表明对连接产物进行脱盐处理也可以明显地提高其效率。另外，对于电转化而言，选择合适的转化电压对不同插入片段的DNA的转化效率也有所不同。构建基因组文库应注意的问题1、构建一个文库，插入DNA和载体DNA的质量是成功与否的关键。基因组DNA应当非常纯以适应DNA的酶解，而且基因组DNA也应足够大（最好超过200kb）以获得两个末端的消化产物。2、不论是载体DNA还是靶DNA不含外源片段是一个基本条件。污染少量探针顺序或载体的基因组DNA将引起很大麻烦，这是因为在筛选过程中它们将被鉴定为所要的克隆。3、部分消化产品应当是一组覆盖整个基因组的随机片段。识别4个碱基的限制酶要比识别6个碱基酶能产生更随机的插入片段。部分消化所产生的片段应能连接到设定的载体上。限制酶和部分消化过程应事先检查。一些批次的酶质量不够高而导致产生的DNA片段末端不能有效地连接。如果预期结果没有出现，检查限制酶和DNA浓度及纯度。4、在考虑把λ噬菌体臂和插入DNA片段连接过程中有两个重要参数：λ噬菌臂和潜在插入片段的比例、基因组DNA的浓度和纯度。大约10pgλ噬菌臂和4μgDNA能产生有效地包装。对一个典型的基因组，要产生一个可表达文库，重组子数一般要大于1×106~6×l06。5、包装抽提物的包装效率贮存于液氮中可保持1年多。而在-70℃中只能保存几星期，而且包装效率还会降低。由于包装抽提物的质量是一个关键性因素，商业性包装抽提物，例如Gigapack（Stratagene），都已有商售。这种包装提取物质量高，且在体外包装λ噬菌体DNA和插入片段过程能产生大量的噬菌斑。二、cDNA文库的构建流程•①细胞总RNA的提取和mRNA分离；②第一链cDNA合成；③第二链cDNA合成；④双链cDNA克隆到载体并导入宿主细胞中繁殖。cDNA文库的标准流程•TotalRNA的提取•mRNA的分离•cDNA双链的合成•载体的制备•cDNA双链和载体的连接•转化或转染•快速鉴定pBlueScriptcDNA库扩增（一）、RNA的分离mRNA的完整性mRNA的丰度（丰度高用质粒，丰度低用噬菌体）mRNA的富集（二）、cDNA第一链的合成反转录酶：AMV（来自禽成髓细胞瘤病毒）和MMLV（来自Moloey鼠白血病病毒）引物：Oligo（dT）和随机引物Oligo（dT）引导的cDNA合成是指Oligo（dT）引物与mRNA3'末端的poly（A）配对，引导反转录酶以mRNA为模板合成第一链cDNA。这种cDNA合成的方法在cDNA文库构建中应用极为普遍，其缺点是由于cDNA末端存在较长的poly（A）而影响cDNA测序。随机引物引导的cDNA合成是采用6－10个随机碱基的寡核苷酸短片段来锚定mRNA并作为反转录的起点。由于随机引物可能在一条mRNA链上有多个结合位点而从多个位点同时发生反转录，比较容易合成特长的mRNA分子的5‘端序列。随机引物cDNA合成的方法不适合构建cDNA文库，一般用于克隆特定mRNA的5'末端，如RT-PCR和5'-RACE。（三）、cDNA第二链的合成自身引导法置换合成法引导合成法煮沸NaOH自身引导法：获得的双链cDNA5’端会有