分子生物学与基因工程

绪论分子生物学广义：研究蛋白质及核酸等生物大分子结构和功能，也就是从分子水平阐明生命现象和生物学规律。狭义：研究生物体主要遗传物质——基因或DNA的结构及其复制、转录、表达和调节控制等过程的科学。基因工程：是指将一种或多种生物体的基因或基因组提取出来,或者人工合成的基因,按照人们的愿望,进行严密的设计,经过体外加工重组,通过一定的方法,转移到另一种生物体的细胞内,使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。里程碑事件：1944年，Avery在肺炎双球菌转化实验中证实了DNA是遗传的物质基础，标志着分子生物学的诞生。1953年，Watson和Crick提出DNA双螺旋模型，为分子生物学的发展奠定了坚实的基础。1961年，法国科学家Jacob和Monod提出了乳糖操纵子模型。1972年，Berg构建了世界上第一个重组DNA分子，开辟了生物学新领域——遗传工程。1983年，Mullis发明了聚合酶链式反应（PCR）技术，极大地推动了分子生物学的发展。90年代，开展了“人类基因组计划”和模式生物的基因组测序，分子生物学进入“基因组时代”。目前，分子生物学进入了“后基因组时代”或“蛋白质组时代”。第二讲核酸的化学成分：核酸是一种高分子的化合物，它的构成单元是核苷酸，是核苷酸的多聚体。核苷酸分子由三个部分组成：碱基：嘧啶、嘌呤五碳糖：核糖或脱氧核糖磷酸…………………………………………脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）（1）DNA含的糖分子是脱氧核糖，RNA含的是核糖；（2）DNA含有的碱基是腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）和胸腺嘧啶（T），RNA含有的碱基前3个与DNA完全相同，只有最后一个胸腺嘧啶被尿嘧啶（U）所代替；（3）DNA通常是双链，而RNA主要为单链；（4）DNA的分子链一般较长，而RNA分子链较短。核酸的分布：真核生物的绝大部分DNA存在于细胞核内的染色体上，它是构成染色体的主要成分之一，还有少量的DNA存在于细胞质中的叶绿体、线粒体等细胞器内。RNA在细胞核和细胞质中都有，核内则更多地集中在核仁上，少量在染色体上。细菌也含有DNA和RNA；多数噬菌体只有DNA；多数植物病毒只有RNA；动物病毒有些含有RNA，有些含有DNA。间接证据：（1）一种生物不同组织的细胞，不论年龄大小，功能如何，它的DNA含量是恒定的，而生殖细胞精子的DNA含量则刚好是体细胞的一半。多倍体生物细胞的DNA含量是按其染色体倍数性的增加而递增的，但细胞核里的蛋白质并没有相似的分布规律。（2）DNA在代谢上较稳定。（3）DNA是所有生物的染色体所共有的，而某些生物的染色体上则没有蛋白质。（4）DNA通常只存在于细胞核染色体上，但某些能自体复制的细胞器，如线粒体、叶绿体有其自己的DNA。（5）在各类生物中能引起DNA结构改变的化学物质都可引起基因突变。直接证据：肺炎链球菌试验；噬菌体侵染实验；烟草花叶病毒侵染烟草实验（RNA）DNA结构：多核苷酸链片段（一级）；双螺旋结构（二级）（1）两条多核苷酸链以右手螺旋的形式彼此以一定的空间距离，平行地环绕于同一轴上；核苷核苷酸（2）两条多核苷酸链走向为反向平行，即一条链磷酸二酯键为5’－3’方向，而另一条为3’一5’方向，二者刚好相反；（3）每条长链的内侧是扁平的盘状碱基，碱基一方面与脱氧核糖相联系，另一方面通过氢键与它互补的碱基相联系。互补碱基对A与T之间形成两对氢键，而C与G之间形成三对氢键。上下碱基对之间的距离为0.34nm；（4）每个螺旋为3.4nm长，刚好含有10个碱基对，其直径约为2nm；（5）在双螺旋分子的表面大沟和小沟交替出现。维持双螺旋结构稳定性的力：（1）氢键（2）疏水作用——碱基堆集力（3）范德华力（4）磷酸基的负电荷静电斥力（5）碱基分子内能Tm：是指吸收值增加的中点。影响因素：1）DNA序列中G+C的含量或比例，含量越高，Tm值也越大（决定性因素）；2）溶液的离子强度；3）核酸分子的长度有关：核酸分子越长，Tm值越大；4）某些化学物质；5）溶液pH值Z-DNA是左手螺旋，每个螺旋含12个碱基对，比A-DNA拧得更紧;双螺旋中不存在深沟，只有浅沟……DNA的精细结构（1）依赖于序列的B-DNA构象变化：双螺旋的许多结构参数是随碱基序列的不同而在一定范围内变化的，这称为DNA的局部构象。在DNA中，随碱基序列的不同而变化的参数有许多，其中重要的有螺旋扭转角、螺旋桨扭角、碱基对转动角等，此外碱基对间还会发生滑动。以上这些变化使DNA形成了精细结构。而精细结构正是DNA发挥功能时，相应蛋白质因子与靶位点作专一性识别和结合的标志。（2）连续AT序列的构象；（3）含错配碱基对的B-DNA；（4）DNA的局部构象与DNA结合蛋白：各种酶（如DNA聚合酶、RNA聚合酶等）；调节蛋白（如CAP，Cro阻遏物等）；这些蛋白质与DNA的结合涉及到生物学中的一些基本问题，如遗传和个体发育等，因此，核酸-蛋白质交互作用已成为分子生物学中的一个研究热点。DNA的超螺旋结构（此处含有一道大题，详见平时的作业本）DNA结构的变化可以用数学式来表述：L=T＋WL称为DNA的连接数；T称为盘绕数；W为超盘绕数。天然的DNA都呈负超螺旋，但在体外可得正超螺旋环形DNA分子会由超螺旋化而变得更为致密，它们在超离心中的沉降速度和在凝胶电泳中的迁移速度都增加，故超螺旋DNA可通过这两种方法来检测和分离。拓扑异构酶含义：指细胞内存在着一类能催化DNA拓扑异构体相互转化的酶DNA中的不寻常结构：交替的嘧啶、嘌呤重复序列倾向形成Z-DNA；反向重复序列倾向形成十字形结构；构成镜像重复的同型嘧啶-同型嘌呤序列可能形成三链结构（T-A-T;C-G-C）；富含G的序列可能形成四链结构（端粒酶）G-GG-Gk对DNA具有特征性，它与DNA的碱基对数目成反相关，因此，Cot曲线提供了一种测定DNA分子量的方法。Cot曲线也揭示单一来源的DNA所具有的不同复杂性部分。Southern杂交鉴别DNA第三讲染色体的结构特征:染色体是由染色质构成的，染色质是由DNA、RNA和蛋白质形成的复合体。组蛋白在进化中是保守的；组蛋白在翻译后是受到修饰的，其中包括特异精、组、赖、丝和苏氨酸残基的甲基化、乙酰基化和磷酸化。染色质基本单位核小体。核小体由约200bp的DNA和H2A，H2B．H3及H4各2分子所组成。念珠状。C值的含义：在真核生物中，每种生物的单倍体基因组的DNA总量是恒定的，称之为C值，它是每种生物的一个特性，不同物种的C值差别很大。C值悖理：一般认为，一个生物的形态学复杂性应该与其C值的大小大致相关，但是，C值和进化之间的复杂性并没有严格的相应关系。DNA的形状与大小：DNA一般为长而无分支的双股线性分子，但有些为环型，也有少数为单股环型。不同的DNA大小相差悬殊。虽然一般而言，复杂的有机体需要更多的DNA，但不存在严格的对应关系。DNA的序列组织：真核生物DNA碱基组成上的异质性主要由于存在着以下3类DNA序列：①高度重复序列（卫星DNA；微卫星DNA：Alu家族）；②中度重复序列（中度重复序列包括rRNA和组蛋白基因，每一基因组约含1000拷贝）；③单一序列（包括酶在内的各种蛋白质基因）。简述真核生物基因组特点（此处含有一个问答大题，详见平时的作业本）第四讲丙氨酸AlaA精氨酸ArgR天冬酰氨AsnN天冬氨酸AspD半胱氨酸CysC谷氨酰胺GlnQ谷氨酸GluE甘氨酸GlyG组氨酸HisH异亮氨酸IleI亮氨酸LeuL赖氨酸LysK甲硫氨酸MetM苯丙氨酸PheF脯氨酸ProP丝氨酸SerS苏氨酸ThrT色氨酸TrpW酪氨酸TyrY缬氨酸ValV蛋白质概述：蛋白质是由20种左右的α-氨基酸通过肽键相互连接而成的一类具有特定的空间构象和生物学功能的高分子有机化合物。α—螺旋和双螺旋的异同点（此处含有一个简答题，详见平时作业）蛋白质功能与结构的关系：蛋白质一级结构是空间结构的基础；一级结构相似的蛋白质，其基本构象及功能也相似；在蛋白质的一级结构中，参与功能活性部位的残基或处于特定构象关键部位的残基，即使在整个分子中发生一个残基的异常，那么该蛋白质的功能也会受到明显的影响——“分子病”的镰刀状红细胞性贫血仅仅是574个氨基酸残基中，一个氨基酸残基即β亚基N端的第6号氨基酸残基发生了变异所造成的，这种变异来源于基因上遗传信息的突变；蛋白质的空间构象是其功能活性的基础。（此处含有一个简答题，详见平时作业）蛋白质的别构效应：在生物体内，当某种物质特异地与蛋白质分子的某个部位结合，触发该蛋白质的构象发生一定变化，从而导致其功能活性的变化。第五、六讲DNA、RNA合成：（分析题）SSBP：单链结合蛋白半保留复制：DNA在复制时首先两条链之间的氢键断裂使两条链分开，然后以每一条链分别做模板各自合成一条新的DNA链，这样新合成的子代DNA分子中一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种复制方式为半保留复制。（名词解释）半不连续复制：DNA复制时，两条链分别作模板，有一条链是连续合成的，这条链称为前导链；而另一条链合成时，只能以5’→3’先合成冈崎片段，然后利用DNA连接酶将各个片段连接起来形成随从链。（名词解释）不对称转录：RNA的转录合成是以DNA的一条链为模板而进行的，这种转录方式又叫做不对称转录（名词解释）解释复制方向5′→3′：RNA聚合酶在DNA复制起始处做为引物，它们的3′—OH末端提供了由DNA聚合酶催化形成DNA分子第一个磷酸二酯键的位置。DNA聚合酶催化dNTP加到引物的3′OH末端，因而DNA合成的方向是5′→3′（简答题）DNA复制过程中的酶：拓扑异构酶IDNA解链酶引物酶DNA聚合酶IDNA聚合酶III/DNA连接酶拓扑异构酶II（填空题）DNA复制时，先由拓扑异构酶作用于DNA双螺旋分子，使之松弛，然后由DNA解链酶作用，解开双链，此时在引发酶的作用下合成一段RNA作为引物，在DNApolIII的聚合作用下连续地合成前导链；随从链的合成依靠多种酶与蛋白质因子的参与：首先在引发酶的作用下合成RNA引物，然后在DNApolIII的聚合作用下合成DNA片段，它们共同形成冈崎片段。RNA引物是靠DNA聚合酶I进行切割的，并由DNA聚合酶I填补RNA引物切除后留下的空隙，最后由DNA连接酶形成一条完整的链。DNA复制的准确性很高，在原核生物中主要依靠DNA聚合酶I的外切活性来校正复制过程中的碱基错配，而真核生物则依靠DNA聚合酶来完成。在真核生物中，DNA复制一般有多个起始点，主要依靠DNA聚合酶α和δ来完成，另外还需要PCNA等多种蛋白质因子参与。DDRP：转录也是一种酶促的核苷酸聚合过程，所需的酶叫做依赖DNA的RNA聚合酶。DDRP：依赖DNA的DNA聚合酶。第七讲参与蛋白质生物合成的物质基础：（1）合成原料。自然界由mRNA编码的氨基酸共有20种，只有这些氨基酸能够作为蛋白质生物合成的直接原料。（2）mRNA是合成蛋白质的直接模板。mRNA以它分子中的核苷酸排列顺序携带从DNA传递来的遗传信息，作为蛋白质生物合成的直接模板，决定蛋白质分子中的氨基酸排列顺序。（3）tRNA是氨基酸的运载工具。tRNA是一类小分子RNA，长度为73-94个核苷酸，tRNA分子中富含稀有碱基和修饰碱基，tRNA分子3’端均为CCA序列，氨基酸分子通过共价键与A结合，此处的结构也叫氨基酸臂。tRNA分子中还有一个反密码环（4）核糖体——蛋白质的合成场所（5）蛋白质生物合成的必需因子。起始因子（IF）。延长因子（EF）。释放因子（RF）。1968霍利柯拉那尼伦伯格遗传密码的特点：（1）起始码（2）终止码（3）密码无标点符号（4）密码的兼并性。一种氨基酸有几组密码子，或者几组密码子代表一种氨基酸的现象称为密码子的兼并性，这种简并性主要是由于密码子的第三个碱基发生摆动现象形成的，也就是说密码子的专一性主要由前两个碱基决定，即使第三个碱基发生突变也能翻译出正确的氨基酸，这对于保证物种的稳定性有一定意义。如：GCU，GCC，GCA，GC