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靶向给药系统的进展和研究中国药科大学平其能一、脂质体制备技术由磷脂及胆固醇等组成具有双分子层结构的微小泡囊(vesicles);单层脂质体（SUV）20~100nm大单层脂质体（LUV）100nm~1000nm多层脂质体（MLV）1~5um（一）组成与结构美国FDA批准的脂质体产品–Doxil阿霉素2019–Daunoxome阿霉素2019–Ambisome两性霉素B2019–Depocyt阿糖胞苷2019美国FDA批准的脂质复合物产品–Ambelcet两性霉素B2019–Amphotec两性霉素B2019国内研究的脂质体紫杉醇硫酸长春新胺羟基喜树碱硝基喜树碱盐酸拓扑替康灯盏花素环孢素反维A酸（二）普通脂质体和长循环脂质体天然卵磷脂合成磷脂PEG-磷脂C-O-CH2-CH-CH2-O-P-O-CH2-CH2-N-CH3CH3CH3OOC-OOOHO-[O-CH2-CH2]n-[o-CH2-CH2]n-[O-CH2-CH2]n-OHLongcirculationliposome;Stealthliposome长循环脂质体（隐形脂质体、空间立体脂质体）PEG-磷脂修饰脂质体实现长循环原理（三）脂质体的制备和生产1、制备技术薄膜超声法逆相蒸发法乙醇注入法化学梯度法（pH梯度法、硫酸铵梯度法、醋酸铵梯度法）冻融法前体脂质体法高压均质、挤出技术脂质氯仿溶液（脂溶性药物）旋转蒸发和真空干燥水合（水溶性药物）多室脂质体(MLVs)超声挤出小单室脂质体（SUV）（1）薄膜蒸发法脂质氯仿溶液/水溶液（药物）旋转蒸发和真空干燥胶态水合（药物）超声挤出小单室脂质体（SUV）（2）逆相蒸发法脂质氯仿溶液旋转蒸发和真空干燥干膜水合（硫酸铵）挤出空白脂质体（NaCl透析，调整pH，解离药物）含药脂质体（4）空白脂质体及化学梯度法对水溶性弱酸或弱碱性药物实现高效包封；PH梯度法：调节酸碱度使内水相药物以离子型、外水相药物以分子型存在，外水相△pH3.7硫酸铵梯度法：弱碱性药物(PNH3=0.13cm.s-1,PSO4=0.01cm.s-1)醋酸根梯度法：弱酸性药物(PAC-=6.6x10-4cm.s-1,Pca+2.5x10-11cm.s-1)金属离子梯度法：Mn硫酸铵梯度主动载药硫酸铵梯度法对弱碱性药物的包封效率高NH（NH4）2SO42NH4++SO4=2H++2NH3R2R-SO4=+R2SO4影响梯度法载药效率的因素1、化学梯度2、包封温度3、脂质类型4、药脂比5、载药介质6、载药工艺硫酸铵浓度的影响在一定浓度范围内，包封率与硫酸铵浓度的增加而增加，当浓度高于0.35M后包封率反而有所下降C-EN%curve5055606570758085909500.10.20.30.40.50.6Cofsulfateammonium（mol/L）EN%温度的影响因为脂膜在相转变温度时的流动性变大，使得药物易于穿透脂膜，加热供给了药物跨越脂膜足够的活化能，使得跨膜反应快速完成如左图为拓扑替康在20℃，40℃，60℃时的载药量与时间的关系曲线形成工艺的影响超滤:超滤膜能截流脂质体能将外水相小分子如硫酸铵等物快速除去，是工业化生产梯度形成的常用工艺。葡聚糖层析：根据分子大小洗脱过程中将胶体系统的脂质体与分子系统的硫酸铵快速分离。可能造成脂质体悬液的稀释，需要提高脂质与药物比例时受到限制透析：用足够体积（通常总体积至少应为样品体积的100倍）的透析介质通过透析过程，交换脂质体的外水相。耗时，透析过程部分脂质体破坏磷脂与胆固醇比例影响相变温度载药介质影响膜的性质（5）乙醇注入法将药物溶于磷脂的乙醇有机相溶液中，水相中含防腐剂、络合剂、电解质等。从管道注入有机溶液，通过高速均质机将有机溶液与水相混合。混合速度可达1500-20000rpm，注入压力为0.1-1000bar,流速从0.1ml/min至1000ml/min,依批量而定。水相溶液的流速是有机溶液的至少50倍；注入过程中保证溶液的充氮以避免磷脂的氧化。乙醇注入法生产脂质体基本装备（四）生产中需要注意的问题1、微量有机溶剂的驱除建议应用无毒或低毒有机溶剂如乙醇、聚乙二醇、乙醚等，并考虑其用量、纯度、溶解度、残留限度等。溶剂可以从通过挥干、透析等手段去除。乙醇的优点是安全，缺点是不易清除，引起脂质双层结构不稳定；批量越小、温度越高的蒸发越有效地逐除溶剂。批量大小的影响比温度的影响更明显。2、抗氧化及除热原抗氧化：磷脂结构中不饱和双键容易在有氧条件下氧化，因此在操作过程中应填充氮气、避光操作及包装、在处方中加入VE或BHT，EDTA等。除热原或内毒素：一般可过滤可去除热原，滤膜表面可以吸附内毒素，但脂质材料也可能携带微生物透过滤膜。选用纯度高、无热原污染的磷脂更为重要，在生产过程中均应保证无菌环境，3、移除游离药物必须移除未包封进入脂质体的游离药物，可以采用凝胶柱分离或超滤，后者特别适合分离未包封的水溶性药物。4、控制粒子大小一般采用挤出或高压均质法；例如微流化机Microfluidizer(MicrofluidicsCorp.)，均质室需用冰浴冷却以降低均质产生的热。5、灭菌脂质体不能耐受热压灭菌及幅射灭菌，小于150nm的脂质体可以适合于过滤除菌，但更大的粒子只能用无菌操作，最好的方案是除菌过滤结合全程的100级的无菌操作环境。但从生产实际及成本上考虑有较大困难。6、高压均质设备（1）Avestin(AvestinInc.,Canada)高压均质设备（2）Microfluidizer(MicrofluidicsCorp.，USA)（五）质量评价1、载药量：药脂比2、包封率：制备效率或脂质体/溶液药量比3、渗漏率：贮存后或应用前包封率下降量；4、粒子大小和均匀度：5、稳定性：氧化磷脂、聚结6、靶向性：相对靶向率、靶向效率二、羟喜树碱脂质体的研究目前临床上羟喜树碱注射液主要用于治疗肝癌、消化系统恶性肿瘤、膀胱癌、肺癌、粒细胞性白血病、癌性腹水等。对Ⅲ～Ⅳ期晚期肿瘤耐药患者（包括鼻咽癌肝转移、胃癌胰腺转移、肝癌骨转移及卵巢癌全身广泛转移等），对晚期耐药性恶性肿瘤有一定的治疗作用。羟喜树碱E环上的α-羟基内酯环是活性的必需基团。羟喜树碱不溶于水，一般用其钠盐水溶液作为临床制剂，但形成钠盐是使其E环上的α-羟基内酯环打开，打开后形成的药物羧酸盐形式表现出极低的抗拓扑异构酶Ⅰ活性。LactoneformCarboxylateformThestructureofhydroxycamptothecin将羟喜树碱及9-硝基喜树碱制备成脂质体，不会使α-羟基内酯环开环，并且因其分子嵌入双层磷脂膜中，可以避免α-羟基内酯环在水环境和血液中开环，从而保持它的生物活性；采用脂质体剂型可以利用脂质体本身的性质，改变羟喜树碱的体内分布，使其具有组织靶向性。羟喜树碱脂质体外观为圆整的球粒，在图中可清晰的看到一圈圈指纹状的磷脂双分子层。相变温度Tm不同药脂比的羟喜树碱脂质体(1:10、1:20、1:30)Tm随着药脂比提高而增加，当药脂比达到1:30时，羟喜树碱脂质体的Tm达44.1℃，从而使得其进入体内后不会因为温度的升高而出现突释。0204060801000510152025Time(hours)Lactonerate(%)HCPTsolutionHCPTliposome羟喜树碱在模拟生理pH环境下开环迅速，10min闭环率即降至84.53℅，4h下降至50%，4h~8h趋于平衡。而羟喜树碱脂质体在模拟生理pH环境下24h羟喜树碱的闭环率仍大于90%。020406080100024681012Time(hours)Lactonerate(%)HCPTcarboxylatesolutionHCPTlactonesolutionHCPTliposome羟喜树碱羧酸盐在全血环境下因为pH变化的原因逐步闭环，闭环率随时间有所增加，至22%左右达平衡；羟喜树碱内酯在全血环境下开环迅速，10min闭环率即降至73.38℅，30min闭环率下降至50%，1h后趋于平衡，达30%左右；而羟喜树碱脂质体在全血环境下闭环率下降速度较慢，至12h羟喜树碱的闭环率仍大于60%。110100100005101520Time(hour)Concertration(ng/ml)HCPTliposomeHCPTinjection同等剂量的L-HPCT静脉注射给药后血药浓度显著高于S-HCPT组，其中2、5、10、15、30、60、120min时分别为S-HCPT组的7.5、5.9、6.2、5.1、4.3、2.7、1.6倍，且可测得的血药时间点多于S-HCPT组。parametersL-HCPTS-HCPTt1/2α(min)11.01±3.23**3.52±1.97t1/2β(min)290.35±249.4999.69±29.16K12(1/min)0.0288±0.0112*0.1736±0.1134K10(1/min)0.0357±0.01390.0479±0.0208Vd0.0242±0.0087**0.0731±0.0325CL(L/kg/h)0.00081±0.00024***0.00296±0.00061AUC(ng.h/ml)11380±4901**2934±564Note：comparedtoS-HCPT，*P0.05、**P0.01、***P0.001。注射脂质体及注射液后的药动学参数L-HCPT和S-HCPT在犬体内的药代动力学特征有显著不同。S-HCPT体内代谢极快，其消除半衰期仅为99.69min。由于S-HCPT代谢快，故静注S-HCPT6小时后即未检出HCPT。L-HCPT静注给药后t1/2α、t1/2β较S-HCPT组明显延长，其中t1/2α有显著性差异；AUC显著增高，K12、K10、Vd均著减小，血药浓度也可维持至18小时。TissueHCPTliposome（blood：μg/ml;Tissue：μg/g）HCPTinjection（blood：μg/ml;Tissue：μg/g）liposome/injectionBlood11.74**0.219753.4Heart3.930**0.106636.9Liver33.25**3.29610.1Spleen47.69**0.3621131.7Lung8.936**0.351025.5Kidney18.58**2.2428.3Intestine23.2522.851.0Stomach2.630**0.73413.6Brain0.3543*0.12832.8注射脂质体及注射液后的组织分布（5min）由结果可见给药5min时，L-HCPT在小鼠组织中分布的浓度顺序为脾肝肠肾血肺心胃脑，脑中含量极低，接近检测最低限量；与S-HCPT组比较，除肠中药物含量相近无显著性差异外，其各组织脏器均显著增高(P＜0.05或P0.01），脾、血、心、肺、肝、肾、胃、脑组织中羟喜树碱含量分别是羟喜树碱注射剂组的131.7、53.4、36.9、25.5、10.1、8.3、3.6和2.8倍。静注给药后1hour，L-HCPT组以肝脏中药物含量最高，余依次为肾、肠、脾、胃、肺，其它组织脏器中羟喜树碱含量大多接近或低于检测限。S-HCPT组肠组织中的药物浓度与L-HCPT组相似，除肝、肾中有少数动物尚能测到外，其余均低于检测限。静注给药后3hour，L-HCPT组动物肝、肾、肠组织中药物浓度为13.27、6.48和1.77μg/g，肝、肠组织中药物含量仍与给药后1hour时相近，肾组织中药物含量明显降低。部分动物的脾、胃、肺组织中尚能测到低浓度的羟喜树碱，余组织脏器及血中羟喜树碱药物浓度已低于最低检测限。S-HCPT组只在肠组织中尚有分布，药物浓度为2.21μg/g，与1hour时药物含量相近。L-HCPT静脉注射给药后，1hour和3hour主要的分布在肝、肾、肠中。3hour