仪器分析 第4章_高效液相色谱分析

第四章高效液相色谱分析4.1、概述及特点4.2、HPLC仪器4.3、高效液相色谱法的类型及分离原理4.4、液相色谱固定性4.5、液相色谱流动相4.6、液相色谱分离类型的选择4.7、高效液相色谱法应用实例4.8、液相制备色谱（自学）4.9、毛细管电泳第一节概述高效液相色谱（HPLC）是一种以液体为流动相的快速分离分析色谱技术，采用细微粒固定相、高压输液泵和高灵敏度检测器，具有高压、高速、高效、高灵敏度的特点，对于那些沸点高，热稳定性差，相对分子质量大的有机化合物如烷烃、烯烃、芳烃、染料、甾族化合物、蛋白质、氨基酸、核酸等均可进行分离分析。按照固定相不同分为：液液分配色谱；吸附色谱（液固色谱）；离子交换色谱；尺寸排阻色谱（凝胶渗透色谱）；离子色谱、平板色谱（薄层色谱）等。1.高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较高压：HPlC供液压力和进样压力都很高（150～350X105Pa）。高压是的一个突出特点。高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV——10-9g,荧光检测器——10-11g。2.HPLC与GC的比较分析对象及范围：流动相的选择：操作温度：GC分析多用于分析气体和低沸点的稳定有机化合物（占总数的20%）；HPLC可分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定有机化合物（占80%）。GC采用的流动相为几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合（供选择的机会多）。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。GC需高温；HPLC通常在室温下进行。第二节HPLC仪器HPLC仪器包括：高压输液装置→进样系统→分离系统→检测系统此外还配有梯度淋洗、自动进样和数据处理装置。梯度淋洗1.高压输液系统1）贮液器：2）脱气：3）高压泵：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)，其孔很小约2m，可防止颗粒物进入泵内。超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去。要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。输液泵种类：恒流型和恒压型。4）梯度淋洗装置：①往复式柱塞泵（恒流型）②气动放大泵（恒压型）4）梯度淋洗装置：作用是在分离过程中，按一定的程序连续改变流动相中多种不同性质溶剂的配比，以改变流动相的极性、离子强度或酸度等，从而提高试样的分离效率，缩短分析时间，使色谱峰形得到改善，提高测定的灵敏度和定量的准确度。2.进样系统1）隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简单、死体积小。但不能承受高压、进样量小且重现性差。2）高压进样阀：装入样品出口进样采样环泵入溶剂进色谱柱目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好。3.色谱柱1）要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头的死体积尽可能小。柱长多为15~30cm，内径为4~5mm；2）柱的填充：主要采用匀浆法（湿法）。填充方法：填充时，将制作好的匀浆液，用流动相充满色谱柱及其延长管中，然后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压力下迅速将其注入色谱柱内。要求填充速度快（防凝聚、沉降或结块）、且无空气进入（影响填充均匀性）。4.检测器1）紫外光度检测器原理：依据被分析试样组分对特定紫外光的选择性吸收，组分浓度与吸光度的关系遵守比尔定律。紫外光度检测器光路图1、高灵敏度，最小检测量10-9g·mL-1；2、对流速和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱；3、结构简单；4、不适用于对紫外完全不吸收的试样，溶剂的选择受限制。特点：光电二极管阵列检测器（PDA或DAD）波长可的松氟美松皮质酮快速扫描—光电二极管阵列（PDA）检测所获得的三维色谱-光谱图2）荧光检测器根据某些物质受激后能产生一定强度荧光的性质，可制成灵敏度极高的荧光检测器。它是一种选择性很强的检测器，其灵敏度比UV检测器高2~3个数量级。适合于具有对称共轭结构的有机芳环分子，如稠环芳烃、甾族化合物、酶、氨基酸、维生素、色素、蛋白质等荧光物质的测定。原理：利用两束相同角度的光照射溶剂相和样品+溶剂相，利用二者对光的折射率不同，其中一束（通常是通过样品+溶剂相）光因为发生偏转造成两束光的强度差发生变化，将此差示信号放大并记录，该信号代表样品的浓度。光源调零光学零参比样品平面镜透镜光电转换记录仪放大器遮光板3）示差折光检测器特点：①为通用型浓度检测器，灵敏度为10-7g•mL－1；②但对温度变化敏感，且不适于梯度淋洗。原理：基于待测物在一些介质中电离后所产生的电导（电阻的倒数）变化来测量电离物质的含量。对温度变化敏感。4）电导检测器属于电化学检测器，主要用于离子色谱的检测。5）蒸发光散射检测器原理：见书本P91特点：①通用型检测器②与示差折光检测器相比，灵敏度高③响应信号不受溶剂和温度的影响，可用于梯度淋洗④对几乎所有样品的响应因子接近一致，因此可以在没有标准品的情况下，采用内标法测定未知物的近似含量（fi/fs接近1）第三节高效液相色谱法的类型及分离原理1、液－液分配色谱法2、液－固色谱法3、离子交换色谱法4、离子色谱法5、离子对色谱法6、空间排阻色谱法一、液－液分配色谱1.原理根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶解度不同，因而具不同的分配系数。在色谱柱中，随着流动相的移动，这种分配平衡需进行多次，造成各待测物的迁移速率不同，从而实现分离的过程。smmsVVkccK2.流动相根据流动相与固定相极性的差别程度，可将液液色谱分为正相分配色谱和反相分配色谱。正相分配色谱：流动相极性小于固定相极性，极性小的先流出，适于极性组分分离。反相分配色谱：流动相极性大于固定相极性，极性大的先流出，适于非极性组分分离。正相色谱低极性流动相反相色谱高极性流动相中等极性流动相中等极性流动相时间时间时间时间待测物极性：ABC正、反相色谱中极性和保留时间的关系3.固定相原则上，用于GC的固定相也可用于HPLC作固定相。但HPLC固定液易流失，因此常用的只有几种，按极性由高到低为：,’-氧二丙腈（ODPN)、聚乙二醇（PEM）、角鲨烷（SQ）。早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相,现多为化学键合固定相（通过化学反应将有机分子键合在载体表面所形成的柱填充剂，具有稳定、流失小、适于梯度淋洗等特点）。二、液－固吸附色谱是基于各组分在固体吸附剂表面上具有不同吸附能力而进行分离。以固体吸附剂为固定相，如极性的硅胶、氧化铝、分子筛和非极性的活性炭等（较常使用5－10nm硅胶微粒）。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。宜于分离极性不同或含极性基团相同但数目不同的试样，也适于分离异构体，但不宜于分离同系物。三、离子交换色谱此法是利用离子交换原理和液相色谱技术相结合，测定各类阴、阳离子的分离分析方法。它既适于无机离子，也适于有机物分离，如蛋白质、氨基酸、核酸等。1.原理：利用不同待测离子对固定相的亲和能力（或离子交换能力）的差别来实现分离的。OHXNRRXOHNR-R:阴离子交换HMSORMHSO-R:阳离子交换33-3-32.固定相按离子交换剂类型分四种：类型官能团强阳离子交换剂-SO3-阳离子交换剂弱阳离子交换剂-CO2-强阴离子交换剂-NR3+阴离子交换剂弱阴离子交换剂-NH2+微孔型大孔型微孔微孔薄膜型表面多孔型离子交换层惰性核惰性核离子交换剂硅胶层涂覆按固定相制作方法可分为：多孔型离子交换树脂(包括微孔型和大孔型)；表面多孔型(包括薄膜型）离子交换树脂；离子交换键合型。3.流动相离子交换色谱流动相为无机酸或无机碱的盐类缓冲溶液（有一定pH和离子强度），通过改变pH、缓冲剂类型、离子强度、加入有机试剂和配位剂等条件来控制分配比k，改变交换剂的选择性，进而影响样品待测物的分离。四、离子色谱（IC）以无机、特别是无机阴离子混合物为主要分析对象。原理:采用交换容量非常低的特制离子交换树脂为固定相；在分离柱后，用另外一支抑制柱来消除淋洗液的高本底电流;采用电导检测器检测流出组分。快速分离分析微量无机离子混合物;各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅速。例如：分析阳离子时，以无机酸为流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换树脂，则发生下列反应：R+—OH+HCl(流动相)——R+—Cl-+H2OR+—OH+MCl(待测物)——R+—Cl+M+OH-可见，不仅大量酸转化为低电导的水，而且待测离子转化为具有更大淌度的碱。特点：分析速度快：可在数分钟内完成一个试样的分析；分离能力高：在适宜的条件下，可使常见的各种阴离子混合物分离；分离混合阴离子（NO3—、NO2－、SO42－、PO43－等）惟一快速、灵敏、准确的最有效分析方法。缺点：抑制柱要定期再生、谱峰在经过抑制柱后会展宽，降低分离度。五、离子对色谱法（IPC）主要用来分离强极性有机酸和有机碱。原理：将与待测物离子A电荷相反的离子B（称为对离子或反离子）加入到流动相中，使待测离子与对离子形成疏水型离子对AB，该AB离子对的性质与A离子或B离子的性质不同，即间接改变了待测离子的保留特性。阴离子分离的对离子：烷基铵类阳离子分离的对离子：烷基磺酸类六、尺寸排阻色谱法又称凝胶（渗透）色谱，主要用于大分子的分子分离。它是基于待测物分子的尺寸和形状不同来实现分离的。1、分离原理：固定相为化学惰性的多孔凝胶，它类似于分子筛，但孔径更大。凝胶内有一定大小的空穴，分子体积大的待测物不能渗入孔穴中而被排阻，较早地被淋洗出来，中等的部分渗透，小分子则完全渗透，最后流出色谱柱。即待测物分子按分子大小（分子量大小）先后从柱中流出。2.固定相3.流动相的要求：能溶解样品且与凝胶相似（润湿凝胶）、粘度小（增加扩散速度）。类型材料型号特点流动相葡萄糖凝胶Sephadax水软性凝胶聚苯乙烯Bio-head-S溶胀,小分子分离有机溶剂聚苯乙烯Styragel有机溶剂半刚性凝胶聚乙酸酯Emgel(OR)溶胀较小流速较小有机溶剂玻璃珠CPG-10有机溶剂和水刚性凝胶多孔硅胶Porasil刚性大、高流速分离有机溶剂和水七、亲合色谱主要用于生物大分子与固定相之间的特异亲合力进行选择性分离及纯化的方法。特点：选择性过滤、纯化效果好。第四节色谱分离方法的选择一般可根据试样相对分子质量范围、溶解度及分子结构等进行分离方法的初步选择。一、根据相对分子质量选择二、根据溶解性选择三、根据分子结构选择分子量水溶性方法流动相可溶排阻色谱水2000不溶排阻色谱水分配色谱(同系物)各种吸附色谱(异构物)各种不溶排阻色谱(分子大小)各种反相液液色谱各种可溶但不解离排阻色谱水阳离子交换色谱(碱)缓冲液可溶且不解离阴离子交换色谱(酸)缓冲液2000可溶离子或非离子反相离子色谱缓冲液第五节高效毛细管电泳简介一、基本原理1、概述在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同可实现分离。毛细管电泳是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据试样中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离、分析物质的一类液相技术，是经典电泳和现代微柱分离的结合。2、电泳现象与电渗流现象电泳现象：带电离子在电场作用下的迁移（定向移动），速度ν电泳电渗流现象：石英玻璃表面存在硅羟基，pH3时,形成双电层，在高电场的作用下，双电层中的水合阳离子引起毛细管中的溶液整体向负极移动，速度ν电渗流3、分离过程：4、分离类型•毛细管区带电泳（CZE）：最普遍、最基本的一种分离模式。•毛细管凝胶电泳（CGE）：将聚丙烯酰胺在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。可分离测定蛋白质、D