仪器分析 第四章__高效液相色谱分析法

生物与化学工程学院仪器分析第四章高效液相色谱分析法第一节高效液相色谱仪第二节主要分离类型第三节液相色谱的固定相与流动相第四节影响分离的因素与分离类型的选择生物与化学工程学院仪器分析第一节高效液相色谱仪美国安捷伦公司Agilent1200生物与化学工程学院仪器分析第一节高效液相色谱仪美国戴安公司UltiMate3000生物与化学工程学院仪器分析第一节高效液相色谱仪一、高效液相色谱仪结构流程二、高压输液系统三、梯度淋洗装置六、液相色谱检测器五、分离系统四、进样系统生物与化学工程学院仪器分析第一节高效液相色谱仪储液瓶高压泵进样器色谱柱检测器废液一、高效液相色谱仪结构流程高压输液泵、高效分离住、高灵敏度检测器生物与化学工程学院仪器分析第一节高效液相色谱仪二、高压输液系统（高压泵）要求：输出压力高；平稳、脉冲小；流量稳定可调；耐腐蚀。机械往复柱塞泵结构图生物与化学工程学院仪器分析第一节高效液相色谱仪三、梯度淋洗装置在液相色谱中,可以通过改变流动相的组成、极性来改善分离和调节出峰时间。生物与化学工程学院仪器分析第一节高效液相色谱仪两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定比例送入混合器，混合后进入色谱柱。一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入混合器中混合。高压梯度(外梯度)低压梯度(内梯度)生物与化学工程学院仪器分析第一节高效液相色谱仪通过改变流动相的组成来调整组分的k值，改变分离因子α值，以达到最短时间内得到最佳分离的目的。梯度洗脱梯度洗脱的特点改善分离,加快分析速度；改善峰形,减少拖尾;可能引起基线漂移。生物与化学工程学院仪器分析第一节高效液相色谱仪四、进样系统六通阀进样装置生物与化学工程学院仪器分析第一节高效液相色谱仪内径：1～6mm，柱长：5～50cm；柱填料粒径：5～10µm为保护色谱柱，通常在柱前加一支填料与色谱柱相同的保护柱。五、分离系统（色谱柱）生物与化学工程学院仪器分析第一节高效液相色谱仪六、液相色谱检测器类型紫外检测器示差折光检测器荧光检测器电化学检测器电导检测器生物与化学工程学院仪器分析第一节高效液相色谱仪（一）、紫外检测器—应用最广泛的检测器基本原理：试样组分对特定波长的紫外光具有选择性的吸收，吸光度与试样组分浓度之间的定量关系符合郎伯-比耳定律。优点：灵敏度高，线形范围宽；死体积小；波长可选；对流速和温度变化不敏感；可用于梯度洗脱。缺点：无紫外-可见吸收组分不响应；流动相选择受一定限制。生物与化学工程学院仪器分析第一节高效液相色谱仪一些常用溶剂的紫外截止波长溶剂二硫化碳氯仿四氢呋喃苯乙睛甲醇水紫外截止波长/nm380245212210190205187生物与化学工程学院仪器分析第一节高效液相色谱仪(a)可变波长紫外检测器(b)二极管阵列检测器生物与化学工程学院仪器分析第一节高效液相色谱仪两种检测器的色谱图(a)：可变波长紫外检测器；(b)：二极管阵列检测器峰纯度检验生物与化学工程学院仪器分析第一节高效液相色谱仪（二）、示差折光检测器—通用型检测器基本原理：连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光系数差值，该值与试样池流动相中的组分浓度成正比。每种物质具有不同的折光指数。生命科学中各类糖类化合物，没有紫外吸收，一般要用示差折光检测器。生物与化学工程学院仪器分析第一节高效液相色谱仪缺点：灵敏度低；对温度敏感；不能用于梯度洗脱。生物与化学工程学院仪器分析第一节高效液相色谱仪（三）、荧光检测器—专用型检测器基本原理：在一定的条件下，荧光强度与流动相中的组分的浓度成之比。对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。生物与化学工程学院仪器分析第一节高效液相色谱仪特点：高灵敏度；高选择性；可用于梯度洗脱。生物与化学工程学院仪器分析第二节主要分离类型一、液-固吸附色谱二、液-液分配与化学键合相色谱三、离子交换色谱四、离子对色谱五、空间排阻色谱六、亲和色谱生物与化学工程学院仪器分析第二节主要分离类型一、液-固吸附色谱流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。固定相：固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等。颗粒度较小，5-10μm分离机理：流动相中的溶质分子(X)与溶剂分子(S)在固体吸附剂上竞争吸附的结果。生物与化学工程学院仪器分析第二节主要分离类型MSSMXnSXnSnsMnMsScXcScXcK下标M、s分别代表流动相和固定相，n代表被吸附的溶剂分子数；K代表吸附平衡常数。吸附平衡常数K不等于分配系数。K值越大，保留时间越长，分配系数大。适用对象：相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性。生物与化学工程学院仪器分析第二节主要分离类型二、液-液分配与化学键合相色谱（一）、液-液分配色谱固定相与流动相均为液体（互不相溶）。基本原理：组分在固定相和流动相上的分配。与气相色谱中气--液色谱比较？改变流动相的组成来改善分离效果。K不仅与固定相的种类有关，也与流动相的种类有关。生物与化学工程学院仪器分析第二节主要分离类型固定相极性流动相极性正相分配色谱（正相柱）组分极性越大，保留时间越长；使用极性化合物的分离。反相分配色谱（反相柱）固定相极性流动相极性组分极性越小，保留时间越长；适用非极性化合物的分离。生物与化学工程学院仪器分析第二节主要分离类型（二）、化学键合固定相色谱固定相非常稳定，在使用中不易流失。由于可将各种极性的官能团键合到载体表面，因此它适用于种类繁多样品的分离。特点将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。生物与化学工程学院仪器分析第二节主要分离类型1.键合固定相制备ODS(C18)键合相硅胶十八烷基氯硅烷非极性硅烷化反应使用pH范围：2-8生物与化学工程学院仪器分析第二节主要分离类型2.键合固定相类型类型反相柱正相柱氨丙基氰乙基、醚和醇等极性基团不同碳原子数的烷烃（C8和C18）、苯基等疏水基团生物与化学工程学院仪器分析第二节主要分离类型保留时间：例：以ODS键合色谱柱、甲醇-水为流动相分离以下两种苯甲酸，试判断出峰次序。COOHOHOHCOOHOHOHHO没食子酸3,4-二羟基苯甲酸固定相:非极性;流动相:极性组分极性:3,4-二羟基苯甲酸没食子酸生物与化学工程学院仪器分析第二节主要分离类型三、离子交换色谱固定相：阴离子交换树脂或阳离子交换树脂。阳离子：－SO3H(强)－CO2H(弱)阴离子：－N+R3(强)－NH2(弱)担体苯乙烯-二乙烯苯共聚物微球键合基团键合生物与化学工程学院仪器分析第二节主要分离类型流动相：阳离子交换树脂固定相，采用酸性水溶液；阴离子交换树脂固定相，采用碱性水溶液。基本原理：试样组分在固定相上发生的反复离子交换反应，依据组分与离子交换剂之间亲和力的不同而分离。生物与化学工程学院仪器分析第二节主要分离类型阳离子交换：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+阴离子交换：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-一般形式：R—A+B=R—B+ABcARcAcBRcKAB试样组分与交换基团间的作用力的大小决定色谱的保留行为。生物与化学工程学院仪器分析第二节主要分离类型阳离子交换：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+阴离子交换：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-组分与离子交换剂之间作用力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。作用大，保留时间长。应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸、蛋白质等。生物与化学工程学院仪器分析第二节主要分离类型四、离子对色谱离子对色谱:用正向或反向色谱柱分离离子和中性化合物混合物的方法。离子对：两个相反电荷的离子相互作用形成一个中性化合物。生物与化学工程学院仪器分析第二节主要分离类型原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相（固定相）中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配。生物与化学工程学院仪器分析第二节主要分离类型由于待测离子的性质不同，与对离子形成离子对的能力不同，形成的离子对的疏水能力不同，在两相间的分配系数不同，从而实现色谱分离。阴离子分离：烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子。阳离子分离：烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子。生物与化学工程学院仪器分析第二节主要分离类型五、空间排阻色谱---凝胶色谱原理：利用凝胶中孔径大小的不同，按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。快速分离不同分子量混合物的色谱方法。生物与化学工程学院仪器分析第二节主要分离类型相对分子质量差别大于10％的化合物才可以分离排阻色谱分离示意图生物与化学工程学院仪器分析第二节主要分离类型六、亲和色谱原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特性亲和力，进行选择性分离的一种色谱方法。具有反应活性的连接链（环氧、联胺等）酶、抗原等生物与化学工程学院仪器分析第三节液相色谱的固定相与流动相一、固定相二、流动相生物与化学工程学院仪器分析第三节液相色谱的固定相与流动相一、固定相固定相分配色谱固定相液-固吸附色谱固定相离子交换色谱固定相空间排阻色谱固定相手性固定相生物与化学工程学院仪器分析第三节液相色谱的固定相与流动相（一）、分配色谱固定相分类全多孔型固定相表面多孔型固定相化学键合固定相多孔球体(氧化铝、硅藻土等)+固定液微珠担体(玻璃微球)+固定液硅胶表面键合有机分子早期固定相已不多见生物与化学工程学院仪器分析第三节液相色谱的固定相与流动相利用硅胶表面存在的硅羟基，通过化学反应将有机分子键合到硅胶表面。化学键合固定相A.硅氧碳键型：≡Si—O—CB.硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si—CC.硅碳键型：≡Si—CD.硅氮键型：≡Si—N生物与化学工程学院仪器分析第三节液相色谱的固定相与流动相ODS(C18)键合相硅胶十八烷基氯硅烷双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主。生物与化学工程学院仪器分析第三节液相色谱的固定相与流动相（二）、手性固定相将手性冠醚或环糊精键合到二氧化硅上。用来拆分生物、药物分子和天然有机化合物。环糊精结构图生物与化学工程学院仪器分析第三节液相色谱的固定相与流动相二、流动相液相色谱的流动相又称为淋洗液，洗脱剂。流动相组成、极性改变，可显著改变组分分离状况，改变流动相的组成和极性（组成比例）是提高分离度的有效手段。常用溶剂：环己烷、己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、甲醇、乙腈、水等。生物与化学工程学院仪器分析第三节液相色谱的固定相与流动相在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。水(最大)甲酰胺乙腈甲醇乙醇丙醇丙酮二氧六环四氢呋喃甲乙酮正丁醇乙酸乙酯乙醚异丙醚二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小)常用溶剂的极性顺序生物与化学工程学院仪器分析第三节液相色谱的固定相与流动相1、尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。选择流动相时应注意的问题2、避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。生物与化学工程学院仪器分析第三节液相色谱的固定相与流动相3、试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。4、流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。生物与化学工程学院仪器分析第四节影响分离的因素与分离类型选择一、影响分离的因素二、分离类型的选择生物与化学工程学院仪器分析第四节影响分离的因素与分离类型选择一、影响分离的因素CuuBAH速率方程2BD溶质在液相流动相中的扩散系数，约为气相中扩散系数的万分之一0uB在大多数情况下，生物与化学工程学院仪器分析第四节影响分离的因素与分离类型选择CuAH修正的速率方程：uDdkkDdkkdHsfMpp