DNA探针

DNA探针什么是DNA探针DNA探针是利用同位素、生物素等标记的特定DNA片断,该片断可大至寄生虫基因组DNA，小至20个碱基。基因探针•基因探针，即核酸探针，是一段带有检测标记，且序列已知的，与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)。分子杂交技术的分类•根据其检测对象不同，可分为检测对象探针Southern杂交DNA核酸Northern杂交RNA核酸Western杂交蛋白质抗体原理当DNA探针与待测的非标记单链DNA（或RNA）按碱基顺序互补结合时，以氢健将2条单链连接而形成标记DNA-DNA（或标记DNA-RNA）的双链杂交分子。将未配对结合的核苷酸溶解后用检测系统（放射自显影或酶检测等）检测杂交反应结果。优点•这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。•DNA探针不易降解（相对RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。•DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移法、随机引物法、PCR标记法等，能用于同位素和非同位素标记。基本操作程序印迹将样品在凝胶上分离，然后将样品通过“影印”的方式转移到固相支持物上（如滤膜）。杂交将已印迹有样品的滤膜与带有放射性标记或其它标记的探针进行杂交。结果检测通过放射自显影或显色反应，判断样品中是否有与探针同源的分子。Southern杂交检测样品DNA的处理电泳分离及变性处理转移并固定到滤膜上探针的制备及杂交检测与分析检测样品DNA的处理•提取检测样品的基因组DNA•用限制性内切酶对其进行酶切，至大小不同的DNA片段电泳分离及变性处理•琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段•变性处理•通常DNA变性的方法：热变性、酸碱变性、化学试剂变性在0.4MNaOH碱性条件下变性凝胶0.4MNaOH转移并固定到滤膜上•通过毛细管虹吸法，将凝胶上的DNA转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上。最后通过紫外线照射将DNA固定在滤膜上。探针的制备•一、探针的合成•PCR、化学合成等方法•二、探针的标记•同位素：3H、35S、32P等•非同位素：地高辛、生物素、荧光素等双链DNA探针的合成方法•切口平移法•随机引物合成法切口平移法当双链DNA分子的一条链上产生切口时,E.coliDNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3'羟基末端。同时该酶具有从5'→3'的核酸外切酶活性,能从切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3'端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。切口平移反应受几种因素的影响(a)产物的比活性取决于[α-32P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。(b)DNA酶Ⅰ的用量和E.coliDNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小。(c)DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性,故应使用仔细纯化后的DNA。注意1、3H，32P及35S标记的dNTP都可使用于探针标记，但通常使用[α-32P]-dNTP。2、DNA酶Ⅰ的活性不同，所得到的探针比活性也不同，DNA酶Ⅰ活性高，则所得探针比活性高，但长度比较短。随机引物合成法随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常,产物平均长度为400-600个核苷酸。利用随机引物进行反应的优点是：(1)Klenow片段没有5‘→3’外切酶活性,反应稳定,可以获得大量的有效探针。(2)反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。(3)反应产物的比活性较高,可达4×109cpm/μg探针。(4)随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。注意1、引物与模板的比例应仔细调整，当引物高于模板时，反应产物比较短，但产物的累积较多；反之，则可获得较长片段的探针.2、模板DNA应是线性的，如为超螺旋DNA，则标记效率不足50%。单链DNA探针的合成方法•以M13载体衍生序列为模板,用Klenow片段合成单链探针;•以RNA为模板,用反转录酶合成单链cDNA探针末端标记DNA探针(1)25μl反应体系中用合适的限制酶酶切1μg的DNA。(2)按下列成分加入试剂并混匀：已酶切的DNA1mg(25ml)10×末端标记缓冲液5ml2mmol/L3种dNTP1ml[a-32P]-dNTP适量加水至50ml(3)加入1单位的Klenow片段,室温下反应30分钟。(4)加入1ml2mmol/L第四种核苷酸溶液,室温保温15分钟。(5)70℃加热5分钟,终止反应。(6)用酚/氯仿抽提后,用乙醇沉淀来分离标记的DNA,或用SephdadexG-50柱层析分离标记的DNA。注意事项1、利用本方法可对DNA分子量标准进行标记，利用它可定位因片段太小而无法在凝胶中观察的DNA片段。2、对DNA的纯度不很严格，少量制备的质粒也可进行末端标记合成探针。3、末端标记还有其他的一些方法，如利用T4多核苷酸激酶标记脱磷的5'端突出的DNA和平末端凹缺DNA分子，也可利用该酶进行交换反应标记5'末端。杂交•预杂交：将结合了DNA分子的滤膜先与特定的预杂液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精DNA或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附。•杂交：在一定的温度和溶液条件下，将标记的探针与滤膜混合，如果滤膜上的DNA分子存在与探针同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，从而吸在滤膜上。检测与分析•1、放射自显影：适用于放射性同位素标记的探针•2、比色或化学发光检测：适于非同位素标记的探针•通过放射自显影或生化检测，就可判断滤膜上是否存在与探针同源的DNA分子及其分子量。DNA亲子鉴定DNA是从几滴血,腮细胞或培养的组织纤内提取而来。用畴素将DNA样本切成小段,放进喱胶内,用电泳槽推动DNA小块使之分离——最细的在最远,最大的最近。之后,分离开的基因放在尼龙薄膜上,使用特别的DNA探针去寻找基因,相同的基因会凝聚于一,然后,利用特别的染料,在X光的环境下,便显示由DNA探针凝聚于一的黑色条码。小孩这种肉眼可见的条码很特别，一半与母亲的吻合,一半与父亲的吻合。这过程重覆几次,每一种探针用于寻找DNA的不同部位并影成独特的条码,用几组不同的探针,可得到超过99.9%的父系或然率或分辨率Thankyou