第四章 抗体分析

第四章免疫球蛋白王晓杜浙江农林大学1.抗体（antibody,Ab）机体免疫细胞被抗原激活后，由B细胞分化成熟的浆细胞合成、分泌的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。两个基本概念2.免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）(1)定义：存在于人和动物血清、组织液及其他外分泌液中的一类具有抗体活性或化学结构与抗体分子相似的球蛋白。(2)存在形式：膜型（membraneimmunoglobulin,mIg）—B细胞膜上的抗原受体；分泌型(secretedimmunoglobulin,sIg)—分泌进入体液,介导体液免疫应答。抗体与免疫球蛋白的异同相同点：化学本质相同都是蛋白质。不同点：抗体是免疫学和功能上的概念，具有针对性，与抗原是对立的，免疫球蛋白并不是都具有抗体活性；免疫球蛋白是结构和化学本质上的概念；抗体多样性极大，免疫球蛋白分子的多样性小。第一节免疫球蛋白的分子结构一、基本结构(一)重链（heavychain，H）2条轻链（lightchain，L）2条(二)可变区（variableregion,V区）恒定区（constantregion,C区）(三)超变区（hyper-variableregion,HVR),又称互补决定区(complementarydeterminingregion,CDR）骨架区（frameworkregion,FR）(四)铰链区（hingeregion）二、功能区（domain）轻链:VL，CL重链:VH，CH1，CH2，CH3(IgG、IgA和IgD)，CH4（IgM和IgE）1.分类2.主要功能(1)VH和VL—抗原结合部位；(2)CH1～3和CL—Ig遗传标志所在；(3)CH2(IgG)、CH3(IgM)—C1q结合部位；(4)CH2～CH3(IgG)—结合并通过胎盘；(5)CH3(IgG)—FcγR结合部位；(6)CH4(IgE)—FcεR结合部位。ImmunoglobulinFragments:Structure/FunctionRelationshipsAgBindingComplementBindingSitePlacentalTransferBindingtoFcReceptors三、水解片段与生物学活性1.木瓜蛋白酶（Papain）IgGFab段(fragmentofantigen-binding,抗原结合片段)Fc段（fragmentcrystalizable,可结晶片段）2.胃蛋白酶（Pepsin）IgGF(ab′)2pFc′3.意义：阐明Ig分子生物学作用；构建基因工程抗体。4.水解片段的生物活性1）Fab片段结合抗原决定抗体分子特异性的部位2）Fc片段与免疫球蛋白选择性通过胎盘有关与补体结合，活化补体有关决定免疫球蛋白分子的亲细胞性与免疫球蛋白通过粘膜进入外分泌液有关决定各类免疫球蛋白的抗原特异性四、其它成分1.连接链（joiningchain，J链)2.分泌片（secretarycomponent,SC）3.糖类(Carbohydrate）第二节免疫球蛋白的多样性1.类和亚类（根据H链的抗原性不同）IgG—γ(gamma)IgA—α(alpha)IgM—μ(mu)IgD—δ(delta)IgE—ε(epsilon)(1)类(2)亚类IgG：IgG1,IgG2,IgG3,IgG4IgA：IgA1,IgA2IgM:IgM1,IgM2一免疫球蛋白的类型2.型和亚型(根据轻链C区抗原特异性不同分型)(1)型κ(kappa)型λ(lambda)型(2)亚型(λ链)：OZ(+)(或λ1)：第190位(亮氨酸)OZ(-)(或λ2)：第190位(精氨酸)Kern(+)(或λ3)：第154位(甘氨酸)Kern(-)(或λ4)：第154位(丝氨酸)IgM(kappa)IgG1(kappa)IgM(kappa)IgG1(kappa)二）同种异型（allotype）同一种属不同个体之间免疫球蛋白也具有的差异性，主要反映在分子的CH和CL上的一个或数个氨基酸的差异(geneticmarkers—遗传标志)。Gm因子：Gm1～30Am因子：A2m1，A2m2Km因子：Km1，Km2，Km3三）独特型（idiotype）在同一个体内，不同B细胞克隆所产生的免疫球蛋白分子V区以及T、B细胞表面抗原受体V区所具有的抗原特异性不同。由免疫球蛋白的超变区特有的氨基酸序列和构型决定。IgG1(kappa)Person2IgG1(kappa)Person1IgG1(kappa)Person2IgG1(kappa)Person1IgG1(kappa)Person1anti-BIgG1(kappa)Person1anti-AIgG1(kappa)Person1anti-BIgG1(kappa)Person1anti-A二免疫球蛋白的基因结构及其表达一）免疫球蛋白的基因库1.H基因库（重链基因连锁群）第14号染色体2.κ基因库（κ链基因连锁群）第2号染色体3.λ基因库（λ链基因连锁群）第22号染色体二）Ig的基因结构及其重排和表达1.κ链Vκ(约100个)、Jκ(5个)、Cκ(1个)2.λ链Vλ(约30个)、Jλ-Cλ(4个)3.H链V基因(约95个)D基因(27个)J基因(6个)C基因(9个)V区VHDJ////200134CHJ//Vk754JVl2ClVlJCl2CkClMouseantibodygenesHumanantibodygenes三）Ig的类别转换1.定义一个B细胞克隆在分化过程中V-D-J功能性基因片段保持不变，而发生C基因重排，使其表达的抗体分子发生H链类的改变，称为类别转换（classswitching）。2.举例B细胞克隆IgMIgGIFN-γIL-4IgEIL-5IgA四）抗体产生的克隆选择学说1.克隆选择学说的基本思想克隆选择学说步骤一克隆选择学说步骤二克隆选择学说步骤三2.克隆选择学说对几个问题的解释1）对抗体产生多样性的解释2）对抗原作用的解释3）对免疫记忆现象的解释4）对免疫耐受现象的解释第三节抗体的功能一）V区的功能—识别并特异性结合抗原单体（IgG,IgE)—2价二聚体(分泌型IgA)—4价五聚体(IgM)—10价（5价）中和效应—中和毒素和病毒与Ag结合—促吞噬细胞吞噬1.抗体的结合价2.实际意义二）C区的功能1.激活补体系统Ab(IgM、IgG)+AgC1q补体经典途径IgG4、IgA和IgE的凝聚物补体旁路途径2.介导免疫细胞活性(1)调理作用（opsonization）：IgG+抗原(颗粒性)FcγR（单核、巨噬细胞及中性粒细胞）促吞噬细胞吞噬；(2)ADCC：IgG+抗原(靶细胞)FcγR（NK细胞）杀伤靶细胞；(3)介导超敏反应：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型超敏反应。3.穿越胎盘和粘膜第四节各类免疫球蛋白的特性和功能一）IgG1.一般特性(1)单体分子；(2)四个亚类；(3)血清中含量最高(75%Ig)；(4)半衰期最长(21～23天)；(5)3～5岁达成人水平(8.0～17mg/ml)；(6)可与SPA结合。IgG1,IgG2andIgG4IgG3IgG1,IgG2andIgG4IgG1,IgG2andIgG4IgG3IgG32.生物学活性(1)通过胎盘（新生儿抗感染）；(2)激活补体（裂解细胞）；(3)调理作用（促进吞噬）；(4)介导ADCC（细胞毒作用）。3.实际意义(1)抗感染；(2)自身抗体自身免疫病；(3)介导变态反应(Ⅱ、Ⅲ型)；(4)封闭抗体肿瘤细胞逃逸；(5)亲合层析法—IgG纯化；(6)免疫学检测。二）IgM1.五聚体，分子量最大(900kd)，又称巨球蛋白；2.人类发育过程中最早合成的Ig；3.体液免疫应答最先产生的Ig—感染早期免疫；4.占血清Ig含量的5～10%；5.半衰期5天—血清中特异性IgM水平增高提示有近期感染；6.激活补体；7.IgM不能通过胎盘脐带血或新生儿血清中IgM水平升高表明胎儿有宫内感染；8.B细胞膜IgM(mIgM)体液免疫应答；9.自身抗体自身免疫病C4JChainC4JChain三）IgA1.两种类型2.半衰期6天；3.占血清Ig含量的5～15%；4.粘膜局部抗感染免疫；5.聚合IgA激活补体替代途径。血清型：IgA1，单体；分泌型：IgA2，二聚体,粘膜局部浆细胞合成；分泌片由粘膜上皮细胞合成；JChainSecretoryPieceJChainSecretoryPiece四）IgD1.单体分子2.存在形式分泌性—血清中，功能不清；膜结合性—B细胞表面,3.意义（1）是B细胞成熟的重要标志；（2）抗原受体；4.占血清Ig含量的1%；5.半衰期3天。TailPieceTailPiece五）IgE1.单体分子；2.血清中含量最低(占Ig的0.002%)；3.半衰期3天；4.呼吸道和胃肠道浆细胞产生；5.介导Ⅰ型超敏反应；6.过敏性疾病和某些寄生虫感染患者血清中特异性IgE水平增高。C4C4第五节单克隆抗体和基因工程抗体一）多克隆抗体（polyclonalantibody）1.定义指由不同B细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原决定簇的多种抗体混合物。如:免疫血清（含多种特异性抗体）。2.实际意义（1）预防、治疗感染性疾病（2）临床诊断二）单克隆抗体（monoclonalantibody,McAb）1.定义由单一克隆B细胞杂交瘤产生的，只识别抗原分子某一特定抗原决定簇的特异性抗体。2.特点具有高度均一性。3.杂交瘤细胞骨髓瘤细胞—无限增殖；免疫B细胞—合成、分泌特异性抗体。4.杂交瘤技术原理及步骤HAT培养基：次黄嘌(H),氨基蝶呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)。嘌呤核酸的主要合成途径和次要合成途径：磷酸核糖、氨基酸、一碳单位及CO2游离嘌呤或嘌呤核苷次黄嘌呤或鸟嘌呤次黄嘌呤鸟嘌呤-次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)腺嘌呤鸟嘌呤氨甲喋呤主要途径次要途径或补救途径主要流程或步骤1.免疫脾细胞的制备2.骨髓瘤细胞制备3.细胞融合4.HAT的选择培养5.阳性克隆的筛选6.阳性克隆的克隆化培养7.扩大化培养8.工厂化生产5.单克隆抗体的应用1）在血清学技术方面2）在免疫学基础研究方面3）在肿瘤免疫治疗方面4）在抗原纯化方面三）基因工程抗体(geneticengineeringantibody)1.定义在DNA水平对Ig基因进行切割、拼接或修饰，导入受体细胞表达的抗体。2.举例嵌合抗体(chimericantibody)重构抗体单链抗体Ig相关分子噬菌体抗体抗体基因库四）催化抗体概念：又称为抗体酶，是具有催化活性的免疫球蛋白，它具有抗体的高度选择性和酶的高效催化性。制备方法：1.细胞融合法2.抗体结合位点化学修饰法3.引入辅助因子法4.基因工程抗体技术应用：抗体介导前药治疗技术等。名称公司抗体类型治疗领域抗CD3单抗/爱欧山古巴分子免疫学中心鼠源器官移植的抗排斥治疗Rituximab/美罗华罗氏/基因泰克嵌合非何杰金淋巴瘤Trastuzumab/赫赛汀罗氏/基因泰克人源化乳腺癌Muromonab-CD3奥多生物技术鼠源器官移植的抗排斥治疗Daclizumab/赛尼哌罗氏/基因泰克人源化器官移植的抗排斥治疗Basiliximab/舒莱诺华制药嵌合器官移植的抗排斥治疗抗CD3单抗武汉生物制品研究所鼠源器官移植的抗排斥治疗抗人il-8单抗乳膏/恩博克宏远逸士生物技术药业有限公司鼠源牛皮癣Cetuximab/爱必妥默克/英克隆嵌合结直肠癌Nimotuzumab/泰欣生百泰生物药业有限公司人源化头颈部肿瘤、消化道肿瘤碘［131I］人鼠嵌合型美恩生物技术有限公司嵌合肺癌肿瘤细胞核单抗/唯美生重组人II型肿瘤坏死因于受体上海中信国健药业有限公司人源化类风湿性关节炎一抗体融合蛋白/益赛普碘［131I］美妥昔单抗/利卡汀第四军医大学/成都华神集团鼠源肝癌我国目前已经批准上市的单克隆药物作业1.名词解释：抗体、免疫球蛋白、抗体的类别转换、多克隆抗体、单克隆抗体、基因工程抗体、人源化抗体、