第十二章 核酸的生物合成-1

核酸的生物合成第十二章中心法则反转录12.1DNA的半保留复制复制时DNA的两条链分开，然后通过碱基配对方式以单链DNA为模板合成新链。这样新形成的两个DNA分子与原来DNA分子的碱基顺序完全一样。每个子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的。这种复制方式称为半保留复制。母链母链子链12.2DNA复制的过程•复制的起始点DNA的复制开始于染色体上固定的起始点。•起始点是含有100－200个碱基对的一段DNA。•DNA的复制是随着解链和解旋同时进行的（复制叉）。DNA复制的方向•DNA复制可以朝一个方向，也可以朝两个方向进行。•大多数生物染色体DNA的复制是双向进行的。•在迅速生长的原核生物中，第一个染色体DNA分子的复制尚未完成，第二个DNA分子就在同一个起始点上开始复制。•在真核生物染色体的不同位置上有多个起始点。如，在30000个碱基对长的果蝇染色体DNA上有2000－3000个复制起始点。•复制叉移动速度慢，但数目多，因此，真核生物染色体DNA复制的总速度比原核生物快。DNA复制所需要的原料？模板dNTP引物DNA聚合酶Mg2+n1dATPn2dGTPn3dCTPn4dTTP++++DNADNA聚合酶Mg2+dAMPdGMPdCMPdTMPDNA+(n1+n2+n3+n4)PPi引物DNA合成起始需要的一段RNA链。引物是在RNA聚合酶（引物合成酶）的作用下合成的。是与DNA模板互补的一小段RNA链。引物具有游离的3’-OH端，因此在DNA聚合酶的作用下核苷酸逐个加到引物的3’-OH端。脱氧核苷酸单位逐个加到引物的3‘端是按照模板链的碱基顺序，遵循Watson-crick碱基配对的原则进行的。DNA链合成的方向是从5‘－3’。•DNA聚合酶I：催化DNA链的延长；外切酶（从3‘或5’端把DNA链水解）•DNA聚合酶II：催化DNA聚合反应；外切酶活性（无5‘－3’外切酶活力）；活性低•DNA聚合酶III：DNA链的聚合；活性最强。DNA聚合酶DNA聚合酶（E.coli大肠杆菌）特性聚合酶Ⅰ聚合酶Ⅱ聚合酶Ⅲ5’-3’聚合酶作用3’-5’外切酶活力5’-3’外切酶活力功能－＋＋（高）＋＋＋＋＋（低）＋（低）修复DNA链修复DNA复制DNA聚合酶（yeast酵母菌）＊模板＊dNTP＊引物(3’-OH)＊DNA链合成的方向(5’-3’)＊合成的两条子链是互补的DNA复制的特性12.3双链DNA复制的分子机制DNA的复制特性——半不连续复制。新的一条链从5‘向3’端（与复制叉移动的方向一致）连续合成，称为“前导链”；另一条链的合成是不连续的，先按5‘－3’方向合成若干短片断（冈崎片断），再通过酶的作用将这些短片断连在一起，称为“后随链”。5‘3‘5‘3‘冈崎片断后随链前导链几个重要的概念前导链以5’-3’方向连续合成后随链不连续合成冈崎片断一般是由1000-2000个碱基对组成，之后在连接酶的作用下链接起来形成一条完整的DNA链。引物引物合成酶DNA聚合酶IIIDNA链的延长引物切除DNA聚合酶I：切除聚合连接酶连接缺口DNA后随链的复制过程DNA连接酶•连接酶催化一个DNA链的5‘磷酸根与另一个DNA链的3’羟基形成磷酸二酯键。•要求:两条链必须与同一个互补链结合；两个链必须相邻；反应需能。后随链的合成过程：复制的起始（RNA引物的合成）链的延长（向引物RNA3’端添加DNA顺序，合成冈崎片断）复制的终止（RNA引物脱落并代以相应的DNA顺序，连接酶连接各冈崎片断）参与大肠杆菌染色体DNA复制的主要蛋白质蛋白质功能DNA旋转酶引入（松解）超螺旋DNA解链酶使双螺旋DNA解链单链结合蛋白稳定单链区引物合成酶合成RNA引物DNA聚合酶III合成DNADNA聚合酶I除去引物并填满缺口DNA连接酶连接DNA片断末端12.4真核细胞DNA的复制基本过程与原核细胞十分相似，主要不同之处：•真核细胞DNA复制有许多起点：DNA复制有许多复制子共同完成。总复制速度要快于原核细胞。•目前已确定，较高等生物中至少有5种DNA聚合酶，各司其职。•端粒的复制：线性染色体末端DNA称为端粒。端粒的复制由一种特殊的酶——端粒酶催化。该酶是一种核糖核蛋白。在真核细胞中，当复制叉到达线性染色体末端时，复制过程在端粒酶作用下完成。12.5DNA的损伤与修复DNA损伤的来由：环境因素：化学因子或辐射等细胞内部原因：正常的细胞内反应过程某些DNA损伤是致死的，但大部分的损伤可以进行胞内修复,以保证细胞的正常生存和繁殖。错配核苷酸的删除或加入DNA重组DNA损伤的类型错配修复光复活修复切除修复DNA的修复机制错配修复DNA聚合酶的校正功能保证了DNA复制的准确性！DNA聚合酶具有3‘－5’外切酶活力是校对新生DNA链和改正聚合酶活性所造成错配的一种手段——当插入一个错配的核苷酸时，酶能识别这种“错误”并立即从新DNA链的3‘端切掉错配的核苷酸，然后在新生链的3’端加上正确的核苷酸。因此，加入的每个脱氧核苷酸单位都受到检查。光复活修复一些物理化学因子如紫外线、电离辐射和化学诱变剂能使细胞DNA受损因而引起生物的突变或致死。紫外光照最典型的DNA损伤是形成胸腺嘧啶二聚体。光复活酶（可见光）专一性高分布广切除修复（暗修复）专一的内切酶DNA聚合酶进行局部修复连接酶限制性内切酶一类能识别DNA特定核苷酸序列的核酸内切酶，简称限制酶。12.6分子生物学中几个常见概念这类酶能在特定核苷酸序列处切开核苷酸之间的键，使DNA产生双链裂口，进而被脱氧核糖核酸酶水解。如果这个识别序列中的碱基经过修饰，限制酶就不再作用。通常寄主的DNA因在该核苷酸序列处被甲基化而得到保护，但外源DNA则因限制酶的作用而分解。高专一性(DNA)特异的结合位点(4~8bp)5’…pGAATTCp…3’3’…pCTTAAGp…5’5’…pGAATTCp…3’3’…pCTTAApGp…5’限制酶的特点：黏性末端5’…pGAATTCp…3’3’…pCTTAAGp…5’平头末端由同一个限制酶切断得到的任何两个DNA片断的黏性末端都可以互相配对，然后每条DNA链的断开部分再通过DNA连接酶连接起来。——基因重组DNA克隆任何DNA片断都能通过先插入质粒或细菌病毒DNA，然后在细胞内进行扩增，这个由单一DNA片断复制成许多相同DNA片断的过程称为“克隆”。•质粒——比较小的双链环形DNA。只占细胞DNA的一小部分，但常含有某些抗性基因。•纯化的质粒常用作克隆载体。•Polymerasechainreaction(PCR)•体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术，即无细胞分子克隆技术。•以待扩增的两条DNA链为模板，由一对仍合成的寡聚核苷酸引物介导，通过DNA聚合酶酶促反应，快速体外扩增特异的DNA序列。（扩增数百万倍）•操作简单，快速，特异，灵敏聚合酶链式反应(PCR)