液相色谱技术及应用

高效液相色谱技术及应用液相色谱高级培训班林子俺博士福州大学化学化工学院食品安全分析与检测教育部重点实验室福建省食品安全分析与检测技术重点实验室2011-9-15目前已发表SCI论文二十余篇，代表性论文：(1)Anal.Chem,2006,78,5322-5328(IF=5.9);(2)J.Chromatogr.A,2007,1170,118-121.(IF=4.2)(3)J.Chromatogr.A,2009,1216,8612-8622.(IF=4.2);(4)J.Mater.Chem.,2011,21,518-524.(IF=5.1)(5)J.Chromatogr.A,2010,1217,4507-4510.(IF=4.2);(6)Chem.Commun.,2011,47,9675-9677.(IF=5.8);林子俺，1977年出生，博士，副教授，硕导，师从色谱专家张玉奎院士，药物分析硕士学位点负责人。研究方向：（1）新型色谱整体材料/磁性纳米材料/生物大分子印迹材料的制备及其在蛋白组学中的应用研究;（2）面向蛋白质组学的液相色谱/毛细管电泳/电色谱联用技术研究；长期担任JournalofChromatographyA,Analyst,Talanta,JournalofSeparationScience,RecentPatentsonNanotechnology,SeparationScience&Technology,CurrentPharmaceuticalAnalysis,《环境化学》等国内外知名刊物评审人。目前，已在国际权威刊物上发表SCI论文20多篇，申请国家发明2项。主持科研项目：1.国家自然科学基金2.教育部博士点（新教师类）基金3.中国博士后基金4.福建省自然科学基金5.福建省教育厅基金6.校科技发展基金内容简介§1液相色谱基本概念色谱发展概况色谱分离原理色谱基本理论§2液相色谱仪器系统及应用输液系统进样系统分离系统检测系统数据输出系统§3液相色谱方法开发和优化色谱方法的选择色谱条件的优化案例分析§4液相色谱常见问题及其解决方法化学因素机械因素色谱起源M.S.Tswett1906年，俄国植物学家M.S.Tswett命名这种应用吸附原理分离物质的新方法为色谱(Chromatography)；60年代末，高效液相色谱（HPLC）崛起；21世纪，超高压色谱、多维色谱等出现，使得色谱技术进入了飞速发展阶段；1952年，James和Matrin发明了气相色谱法；色谱法：利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术；流动相：携带样品流过整个系统地流体；固定相：静止不动的一相，即色谱柱；液相色谱分离原理色谱法的分离原理：溶于流动相(mobilephase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationaryphase)发生作用（吸附、分配、离子交换、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。≠吸附：物质在两相界面上浓集的现象色谱分类分配色谱：是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。吸附色谱：分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝。定义不同色谱分类色谱研究方向高效液相色谱•HighPerformanceLiquidChromatography(HPLC)气相色谱•GasChromatography(GC)薄层色谱•Thin-LayerChromatography(TLC)凝胶电泳•GelElectrophoresis(GE)毛细管电泳•CapillaryElectrophoresis(CE)毛细管电色谱CapillaryElectrochromatography(CEC)0'R00Rtttttkt0tR2112)(2WWRRSttttR＋－＝DetectorResponseTimeABWWABInjectt0tR(A)tR(B)影响因素：柱效、选择性、容量因子容量因子A：涡流扩散;B：分子扩散;C：传质阻力;分离选择性t0=1=k'k'BAAB23AB12AB12==2.642.58=1.02=2.151.85=1.16=1.951.63=1.20k'k'BA改变流动相的组成改变不同流动相改变流动相pH值改变柱温应用特殊的化学效应改变固定相GreaterThan1.2(α)NeedNotBetW=R=1/4Nx-1xk'1+k'容量因子选择性柱效不同分离度比较PoorefficiencyModerateselectivityPoorefficiencyGoodselectivityExcellentefficiencyPoorselectivityExcellentefficiencyModerateselectivityR=1R=1.5R=0.5R=4•（1）分配系数k’k’k’β•（2）容量因子“k’”：•或：••“k’”是比“tR”还常用的保留值，它与柱子的大小及流速无关，只与溶质在固定相和流动相的分配性质、柱温以及相空间比（即固定相和流动相之体积比）有关。“k’”又定义为在分配平衡时某溶质在两相中绝对量之比，消除了保留值的波动因素，而分配系数“K”是平衡时物质在两相中的浓度比。•k’值的范围：0.4＜k’＜20～30；k’＝2～5为佳，过大则耗时太长。00,tttkR－＝溶质在流动相中的量溶质在固定相中的量＝'k思考：为什么要优化流动相比例？KA≠KB或k’A≠k’B是色谱分离的前提!柱效DetectorResponseInjectTime高柱效低柱效柱效率（热力学）：•定义：理论塔板数(每米柱效)：ơ—标准偏差，曲线拐点处峰宽的一半，即峰高0.607处峰宽的一半。为便于测量，改用半峰宽：W1/2(或2×△t1/2)最常用的计算式：另一计算式：（Wb不如W1/2容易测量，因而此式用的较少。)22/154.5WtNR＝216bRWtN＝2RtN＝2ơ1/2h1/2hW1/2HL范氏方程(动力学)：1、柱内展宽：H=A+B/μ+Cμ(A：涡流扩散B：纵向扩散C：传质阻抗)气相GC中B=2rDm中Dm比HPLC中大105倍在HPLC中第二项可忽略，故高效液相色谱的范氏方程为：H=A+Cμ2.6µm2.6µmmin01234567mAU020406080w1/2tRSub-2µmparticles初始带宽最终带宽AA=涡流扩散－多径扩散仔细填充柱子使用粒径均一的载体线速度HETP扩散min01234567mAU020406080w1/2tR3µmand5µmparticlesDispersionduetoeddydiffusionormulti-patheffect扩散BB=自由分子扩散－纵向扩散在液相中影响小在低流速中影响大线速度HETPmin01234567mAU020406080w1/2tRmin01234567mAU020406080w1/2tRVerylowlinearvelocityAtoraboveoptimumlinearvelocityZerolinearvelocity扩散滞流的流动相流动相固定相C=传质阻力在低流速下可以降低传质阻力使用小颗粒载体可以降低传质阻力HETP线速度min01234567mAU020406080w1/2min01234567mAU020406080w1/2min01234567mAU020406080w1/25µm3µmSub-2µm扩散HETPBuA线速度A=涡流扩散－多径扩散B=自由分子扩散C=传质阻力TheVanDeemterEquation总原则：①固定相填料要均一，颗粒细，装填均匀。②流动相粘度低。③低流速。HPLC分离模式近年来新的HPLC法应运而生我们仅讲其中部分内容：HPLC高效液相LSC液固LLC液液IEC离子交换SEC空间排阻AC亲和色谱CE毛细管电泳BPC化学键合相NPBC正—RBPC反—PIC离子对ISC离子抑制液相色谱仪器系统及应用HPLC硬件基础知识日常应用注意事项液相系统维护流程图吸滤头单向阀柱塞密封圈线路过滤器手动进样器检测器色谱柱5大系统：（1）输液系统；（4）检测系统；（2）进样系统；（5）数据处理系统；（3）分离系统；接头不锈钢接头/垫圈主要用于输液泵、进样器的连接–能承受400kgf/cm2压力–一旦固定，垫圈不可再动PEEK接头主要用于色谱柱、检测器的连接–易于安装–能承受250kgf/cm2压力–容易产生死体积不锈钢接头垫圈PEEK接头输液系统死体积•死体积可能会引起分离度变差和重现性变差等问题.管线公螺母死体积好的连接差的连接选择原则•采用“HPLC”级溶剂•避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂•对试样有适宜的溶解度•溶剂粘度要小•与检测器相匹配流动相•溶剂的等级–HPLC级–优级纯–分析纯都经过蒸馏和0.45u的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒）优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂HPLC级经过0.2u的过滤,且除去有紫外吸收的杂质微量分析、梯度洗脱流动相有机溶剂的等级•分析纯级和HPLC级溶剂的吸光度比较图分析纯色谱纯•水的等级–纯化水–蒸馏水–去离子水波长(nm)纯化水去离子水因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高纯化水中去除了无机和有机的污染物吸光率流动相水的等级•未注入样品时空白梯度的色谱图水中的不纯物保留在柱中，随之被乙腈洗脱.•选择缓冲液的步骤1.确定最佳分离状态时的流动相pH2.选择具有与流动相的pH相近的pKa的缓冲液（即使浓度稀也具有较强能力的缓冲液）3.确认检测波长下缓冲液是否有大的吸收（在波长210nm附近进行检测时，不能用醋酸和柠檬酸的缓冲液）流动相缓冲盐pK1pK2pK3醋酸4.87柠檬酸3.134.766.40磷酸2.167.2112.32常用代表性的弱酸的pKa值缓冲液的使用使用前必须过滤使用后一定要进行清洗，以免造成腐蚀、磨损、阻塞:用含5%甲醇的水溶液冲洗30min（1ml/min），再用甲醇冲洗30min用纯水冲洗泵头清洗管路易受到细菌和霉菌的影响不能直接用有机溶剂冲洗缓冲盐溶液缓冲液流动相的更换不互溶的流动相不能直接更换缓冲盐不能直接用有机溶剂更换水正己烷异丙醇缓冲盐有机溶剂水过滤：0.45um或更小孔径滤膜目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液时。滤膜类型：聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐。醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶剂。尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于强酸，不适用于二甲基甲酰胺。再生纤维素滤膜：蛋白吸收低，同样适用于水溶性样品和有机溶剂溶剂前处理吸滤头材料：不锈钢(或陶瓷)烧结，孔径10um故障：堵塞表现：管路中不断有气泡生成措施：用异丙醇（或5％稀硝酸），超声波清洗，再用蒸馏水清洗溶剂前处理-脱气•脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡•气泡对测定的影响：•1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积•2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形•3）检测器中的气泡产生基线波动溶剂前处理-脱气常用脱气方法•超声脱气•减压脱气•在线脱气岛津液相输液泵柱塞泵的基本结构•LC-10ATvp•LC-20AT•串联式柱塞往复泵•LC-10ADvp•LC-20AD•并联式微体积柱塞往复泵LC-20ATLC-20ADLC-20AB柱塞往复泵结构示意图GoldSealSapphireInsertRubyBallSpringInsert单向阀工作原理单向阀结构请不要分解阀心A和阀心B重新组装后性能不被保证，输液可能不稳定注意：单向阀清洗故障：宝石球或球座受污导致密封不好表现：系统压力波动大措施：打开排液阀，以异丙醇为流动相输液拆下单向阀，放入异丙醇中，超声波清洗注意：超声清洗时开口端向上放置。故障：宝石球粘附于垫片表现：泵无法吸液或排液，流路不通