电镜三维重构I

内容数学工具透射电镜高分辨电子显微镜的成像原理高分辨电子显微镜的图像处理电镜三维重构的原理电镜三维重构的应用数学工具δ函数富里叶变换富里叶变换的性质富里叶变换的例子卷积定理、相关函数δ函数定义：axaxax,0,)(1)(dxax（a在x积分区间内）δ函数例子)2/exp(212x)()2/exp(2120limxx2/||,02/||,/1lxlxll)(lim0xll例1例2δ函数的简单性质)()()(afdxaxxf)()(xx)(||1)(xaax)()()(badxbxaxδ函数的简单性质0)(xx)]()([||21)(22axaxaaxaxnnnnnxxfdxxaxxf|)()1()()(三维δ函数000,0,)(rrrrrr1)(0rrrdr0点在积分体积内三维δ函数在不同坐标系中的表示)()()()(0000zzyyxxrr)()()(1)(0000zzrr在直角坐标系在柱坐标系在球坐标系)()()(sin1)(00020rrrrrδ函数与晶体nnnaxx)()()(),(barnmyxmn一维晶体：三维晶体：二维晶体：)(),,(cbarnmlzyxlmn富里叶变换函数ρ(r)与F(H)满足如下的变换关系：rrHrHdiF)2exp()()(HrHHrdiF)2exp()()())(()(rHFTF))(()(rHFFF(H)称为ρ(r)的富里叶变换，记为ρ(r)为F(H)的反富里叶变换))(()(HrFIFT))(()(1HrF-F一维富里叶变换dxikxxkF)2exp()()(dkikxkFx)2exp()()(dxdykyhxiyxkhF))(2exp(),(),(dhdkkyhxikhFyx))(2exp(),(),(二维富里叶变换可逆已知F(H)，则可以导出ρ(r))()(HrFIFTFT),(),(khFyxIFTFT)()(kFxIFTFT富里叶变换的性质---1.乘以常数))(())((rrFFcc特例：)exp()()())((iFFHHrF推论：相衬相反的两张像，富里叶变换的振幅相同，但相位相反。因此，冰包埋样品和负染样品的富里叶变换的相角相差180o2.线性性质))(())(())()((22112211rrrrFFFcccc))(())(())()((rrrrhphpFFF特例：c1=1,c2=1若ρp和ρh分别表示蛋白质和重金属原子的电子密度，上式左边则代表重原子衍生物的电子密度的富里叶积分，右边ρp和ρh分别为蛋白质和重金属原子的电子密度的富里叶变换。从实验测定重原子衍生物和重金属原子的电子密度的富里叶变换，由上式就可以测定蛋白质的结构。3.相似性质)/(||1))((cccHrFF放大/压缩一个物体，其富里叶变换相应的缩小/放大4.位移物体的富里叶变换)exp())(())((rHrrr0iFF样品的漂移改变其富里叶变换的相位，但不改变振幅，因此对形成的像有影响，而对电子衍射图没有影响5.旋转物体的富里叶变换)sinsin,sincos()cossin,sincos((yxkhFyxyxF旋转一个物体θ角，其富里叶变换相应旋转θ角6.实函数的富里叶变换)()(HHFF)exp(|)(|)(HHHiFF若ρ(r)是一个实函数，则其富里叶变换满足:又，|F(H)|通常被称为振幅,φH为相位。上式表明中心对称的两个衍射点之间的关系为：HHHH|)(||)(|FF只需记录一半的衍射数据富里叶变换例子---1.δ函数1))((xF)(x1))((xF一个δ函数：二个δ函数：)2cos(2))()((kaaxaxF)()(axaxxk2/2/)()(NNnnaxx)sin()sin()(kakaNkFN个δ函数无穷个δ函数nnaxx)()(nankkF)/()(2.盒子的富里叶变换0||,02/||,1)(xaxx-a/2a/2kakkF/)sin()(过氧化氢酶的高分辨像强暴光和弱曝光下的衍射图(EriksonandKlug,1971)BacterialrhodopsininglucoseFouriertransformofimage.电子衍射图包含的信息衍射点的位置----〉晶胞的大小和形状电子衍射图包含的信息衍射点的位置---〉晶胞的大小和形状衍射点强度及背景的强度---〉信噪比电子衍射图包含的信息衍射点的位置---〉晶胞的大小和形状衍射点强度及背景的强度---〉信噪比最远能分辨的衍射点---〉分辨率电子衍射图包含的信息衍射点的位置---〉晶胞的大小和形状衍射点强度及背景的强度---〉信噪比最远能分辨的衍射点---〉分辨率Thonring---〉离焦值电子衍射图包含的信息衍射点的位置---〉晶胞的大小和形状衍射点强度及背景的强度---〉信噪比最远能分辨的衍射点---〉分辨率Thonring---〉离焦值椭圆Thonring---〉像散值卷积定理、相关函数卷积定义ξξ)ξ-rrrdgfgf()()(*)(卷积定理r))rrr(())(())(*)((gfgfFFF分子=f(r)晶格=l(r)相关函数定义ττrτrdffC)()()(21特例：自相关函数ττrτrdffC)()()(主要应用：Patterson函数；晶格畸变矫正；测定一个投影像的方位角。透射电镜透射电镜发展简史透射电镜的构造光源与分辨率与扫描电镜的区别电镜三维重构技术的发展史1924De.Broglie提出物质波理论，并被电子衍射实验证实1926年,H.Busch提出轴对称磁场可以汇聚电子束，并服从几何光学定律1932年E.Ruska研制出第一台电子显微镜20世纪30年代，晶体衍射分析1949年，Bacl2·H2o晶体结构1968年，Klug&DeRosier，烟草花叶病毒。首次提出电镜三维重构方法。电镜三维重构技术的发展史1975年，Henderson和Unwin重构了细菌视紫红质(Bacteriorhodopson)的7Å分辨率的三维结构。------电子晶体学的一个里程碑。1982年，Klug获得诺贝尔化学奖。1990年，Henderson等人把细菌视紫红质的研究提高到了3.5Å分辨率，并提出了原子模型。1994，Kühlbrandt&Wang，LHC-II，3.4Å2005，ThomasWaltz，APQ0，1.9Å透射电镜的构造光源与分辨率---〉可见光sin*61.0nr可见光波长（390nm-780nm），分辨率由下式决定：分辨极限：n=1,α=90,λ=390nm0.61*3902380.21*sin90nmrnmm光源与分辨率---〉X-raysin2r晶体结构分析中常用X-ray的波长（0.05nm~0.25nm),分辨率用下式估算：分辨极限：θ=90，λ=0.05nmnmr025.090sin205.0光源与分辨率---〉电子束电子枪示意图电子的波长：21216/)10978.01(25.12VVV为加速电压（伏特），波长的单位为ÅV(kv)λ(Å)----------------------------------------500.05481000.03882000.02514000.016410000.0123透射电镜分辨率点分辨率4/34/165.0sdCr分辨率由电子波长和球差系数决定。分辨率由电子波长和球差系数决定。特例：JEOL-100CX，Cs=1.2mm,V=100kV,rd=3.3Å各种光源的分辨极限光学显微镜分辨率低于0.2μmX-ray分析范围低于0.5Å电镜的分辨率低于1.9Å与扫描电镜的区别入射电子束二次电子背散射电子入射电子束透射电子束衍射电子束扫描电镜透射电镜与扫描电镜的区别成像原理不同。透射电镜与样品的原子核相互作用，而扫描电镜与样品相互作用，使样品中的原子外层电子受激发，产生二次电子成像。分辨率不同。透射电镜可达到1.0Å，而扫描电镜在15~60Å之内。观察的面积不同。透射电镜的视野范围在0.1微米到1毫米，而扫描电镜可达10微米到10毫米样品的制备不同。透射电镜的样品一般在几百埃内，而扫描电镜没有厚度的限制。样品的辐射损伤不同。透射电镜对样品的损伤大，而扫描电镜比较小。高分辨电子显微像的成像原理入射电子束与样品的相互作用–运动学电子衍射理论物镜的成像原理–理想物镜的成像–衬度传递函数像衬近似理论–弱相位体近似高分辨电子显微像的成像原理高分辨电子显微像的成像原理电子波从物体的后表面传播至物镜前表面；从物镜的前平面传播至物镜后平面；电子波传播到物镜的后焦面形成衍射波；各种像差对衍射波的调制；被调制的衍射波传播至像平面，干涉形成像面波。像面波振幅的平方就是像的强度。入射电子束与样品的相互作用非弹性散射弹性散射-25eV用σe和σi表示弹性和非弹性散射的散射截面19ZieZ为原子序数。对于生物样品，大多数原子的Z小于19，因此，非弹性散射占主导地位。入射电子束与样品的相互作用入射电子束经过样品受到弹性和非弹性散射。入射电子与原子核势场的相互作用通常为弹性散射，电子的波长不变。电子与样品的外层电子发生非弹性散射，散射后电子的波长会发生改变，同时，一部分能量(约25ev)会传递给样品。弹性散射产生的相干作用形成高分辨电子显微像的衬度和电子衍射花样。非弹性散射则在电子衍射花样上产生一径向分布的背景噪音。原子序数越小，非弹性散射越大。对于生物样品，因此非弹性散射占主导地位，使得生物样品易受辐射损伤，形成衬度较差。运动学电子衍射理论---〉运动学近似散射线的强度远低于入射线的强度。不考虑入射波和散射波的相互作用。只处理一次散射过程。不考虑散射波的二次散射或高次散射。源点和场点到散射体的距离足够远，因此入射波可用平面波近似；散射体或散射系统的线度很小，可以看作质点。运动学电子衍射理论---〉主要结论电子散射振幅是散射势场的傅里叶变换对于晶体，衍射的强度等于结构振幅的平方乘以干涉函数散射势场φ(r)入射波出射波散射势场电子散射振幅FT2/a衍射强度的分布物镜的成像原理---〉理想物镜物平面后焦面像平面uvfq(r)Q(r)ψ(r)没有像差，且在高斯面上成像，即满足：vuf111物镜的成像原理---〉理想物镜电子波从物体的后表面传播至物镜前表面；从物镜的前平面传播至物镜后平面；电子波传播到物镜的后焦面形成衍射波；衍射波传播至像平面，干涉形成像面波。像面波振幅的平方就是像的强度。物镜的成像原理---〉理想物镜))(()(ruqQF像平面上的波函数与后焦面上的也是富里叶变换关系后焦面上的波函数与物面波是富里叶变换关系))(()(urQF因此，)()))((())(()(rrurqqQFFF像平面所成的是放大倒立的像物平面后焦面像平面uvfq(r)Q(r)ψ(r)衬度传递函数---〉像差成像平面不是在高斯面上（(离焦）物镜对远轴和近轴电子束会聚能力的不同（球差）电子透镜不是严格意义上的轴对称，导致沿不同方位的焦距不同（像散）物镜光栏对参与成像的衍射束数目的限制（光栏函数）电子束不