电镜超薄切片3

（5）包埋(embeding)：目的:包埋的目的是让包埋剂完全浸透到组织内部，经加温逐渐聚合成坚硬的固体，成为细胞结构的支架，能够承受切片的各种力的作用，有利于切薄片。包埋剂的性质:①粘度适中，有良好的切割性能。②能耐受电子束的轰击，高温不易升华、不变形。③透明度好。④对人无害。包埋剂的种类①环氧树脂类：目前国内使用较多的环氧树脂有进口的Epon812和国产的618。原理:环氧树脂具有环氧基和羟基两个主要化学反应基团，环氧基是线型聚合物的末端，易与其它含活性氢原子的化合物如胺类反应，形成首尾相接的长链状聚合物。而单体中的羟基能与酸酐结合，形成分子间的横桥连接。因此，将环氧树脂、胺类和酸酐三者按比例混合，在一定温度条件下，可形成具有三维空间结构的交链状聚合物。这种聚合物收缩率小、均匀，组织损伤小，耐电子束的轰击。包埋后可保存细胞内的微细结构。其缺点是粘度较大，操作不便、切片较为困难，而且反差较弱。②低粘度包埋剂(Spurr)为适应临床诊断电镜的需要，目前低粘度包埋剂的应用已日趋广泛。这是一种低粘度的树脂，能较好地渗入组织内部，对组织结构保存好，耐电子束轰击，可广泛应用于各种生物材料，尤其适宜于较致密的组织。③水溶性包埋剂：是进行细胞化学研究较理想的包埋剂。原理:水溶性包埋剂可以在较低温度的紫外线照射下进行聚合，避免了一般包埋剂必须在高温下聚合而给酶活性带来的破坏，所以是酶活性定位和定量研究十分优良的包埋剂。包埋剂:DurcuPan、乙二醇甲基丙烯酸脂(简称GMA)、聚乙二醇、Aquon等④所加的固化剂，有十二烯基虎铂酸酐（DDSA）和甲基内次甲基四氢苯二甲酸酐（MNA）,增韧剂为邻苯二甲酸二丁酯（DBP）,加速剂为2,4,6,一三苯酚（DMP—30）。1环氧树脂的性能和配制：618树脂5ml十二烯基丁二酸酐DSA（固化剂）5ml苯二甲酸二丁酯DBP（增塑剂）0.3ml2,4.6三苯酚称DMP30（加速剂）0.1ml60oC烘箱内加温使粘度下降，用量杯量取所需要的量，一次加入固化剂、增塑剂、加速剂，边加边搅拌，最后充分搅拌10分钟，至37oC温箱中使气泡逸出。Epon812的配制A液：Epon81262mlDDSA(固化剂)100mlB液：Epon812100mlMNA(固化剂)89mlA液和B液分别配制，使用时用不同比例将二者混合后再加1.5%DMP-30(加速剂)即可。A液和B液的比例：冬季2：8。夏季1：9。B液可以增加包埋块的硬度。1）包埋的方法常规包埋①将浸透在包埋剂的组织块，转移到包埋囊中，使之位于囊的中央，然后加包埋剂。②把写好标本块编号的小纸条卷成环状，放入囊中，插入包埋剂中。③不加盖，37oC过夜，这也就是纯包埋剂浸透。④次日，升温到60oC48小时固化。⑤固化完毕，关温箱，自然冷却。⑥去掉外壳，取出组织包埋块将组织包埋块，存放在干燥器中。定向包埋：注意事项①防潮、干燥。②包埋剂要充分混匀。③防气泡。④包埋后立即清洗器皿。⑤自身保护。⑥干燥器中存放包埋块。思考题1、试说明显示酸性磷酸酶有几种方法？2、试设计在超微结构水平显示周期抑制蛋白P53的实验方法和步骤。（6）切片1）选择和清洗载网。常用的载网有圆形的铜网，细胞化学和免疫组织化学常用镍网、不锈钢网和银丝网。直径为3mm，目数为200-3002）支持膜的制备：①福尔莫瓦膜：常用氯仿配制的0.2%-1.5%的聚乙烯醇缩甲醛液（formrar）。注：制膜时室内的温度小于60%，否则会出现白点。②火棉胶膜：特点，火棉胶膜的机械强度比福尔莫瓦膜弱，但制作容易。常用1-2%醋酸异戊酯溶液采用漏斗法和贴附法制膜。③帕罗丁支持膜：目前国外比较常用，一般配制30%左右的帕罗丁醋酸戊酯溶液制膜，方法同火棉胶同。④碳膜：炭膜的机械程度和稳定性较好，适用于高分辨率的观察，用真空喷镀仪采用碳升华喷镀法制备。⑤复合膜：有机膜上喷镀5-10nm的碳膜。⑥微孔支持膜：高分辨率观察使用。2）包埋块修整：修成四面锥体（45oC角）5）超薄切片机的构造6）切片操作7）切片厚度:灰色40-50nm银灰色50-70nm金黄色70-90nm紫色90nm以上(7)染色1）常用的电子染色剂醋酸铀(UO2(CH3COO)2.2H2O：特性：具有放射性和毒性，对光不稳定，储存、染色最好闭光，变混则失效。广泛使用，能产生较高的反差。主要是提高核酸、核蛋白和结缔组织纤维成分的反差；对糖分、分泌颗粒、溶酶体等也能染色，但对膜的结构染色较差。常用浓度：50%-70%的乙醇或丙酮配制的2%-3%的溶液。染的时间：组织块染色时间为1-2h或过夜。片染30min即可。枸橼酸铅（leadacetate）：特点：①毒性大。②与空气中的二氧化碳结合形成白色的碳酸铅沉淀。③高PH（11-12）染色效果好。也是目前最广泛使用的染色液。它具有很高的电子密度，对细胞超微结构均有广泛的亲和性，能提高细胞膜系统及酯类的反差。枸橼酸铅（leadcitrate）溶液的配制硝酸铅〔Pb(NO3)2〕1.33g枸橼酸钠〔Na3(C6H6O7).2H2O〕1.76g双蒸水30ml混合后振荡30min呈乳白色，加1.0mol/L新鲜配制的NaOH8ml双蒸水加至50ml调PH到122）染色方法A、手工染色①单染色：用一种染色液；一般材料铅染好，免疫组化铀染好。②双染色：先用醋酸铀染色，再用柠檬酸铅染色。③块染色：锇酸固定后，脱水前用50%-70%的乙醇醋酸铀染液染色20-30min，也可在脱水过程中放入含1%-2%的醋酸双氧铀的70%乙醇染液染2-10h（4oC冰箱）这样可以省去切片后的铀染过程。B自动染色：自动染色使用事先制好的，已商品化的醋酸铀和柠檬酸铅，在自动染色仪内进行电镜常规染色。2、半薄切片的制备3、几种特殊样品的制备（1）甲醛固定石蜡样品：脱蜡复水，锇酸固定，以下步骤同。（2）培养细胞及游离细胞：（3）血细胞制品（4）骨组织：骨组织固定液固定，脱钙，以下步骤同。微波快速制样：全部和部分微波处理4——5小时完成。4负染色技术1）定义：负染色技术是利用高密度无结构的重金属物质把生物标本包绕起来的一种技术。2)应用：常用于病毒蛋白分子或细胞亚单位的分子结构研究。负染色样品的制备悬浮样品常用的制备方法有直接取材法、样品提纯法、细胞培养取材法、抗体-病毒凝集法、冷冻超薄切片负染色法等（1）直接取样法对于某些皮肤病毒性疱疹(如天花、水痘及疱疹等)可用毛细吸管直接刺人疱疹中取样，再将吸管中的泡液滴在带有支持膜的铜网上，待稍干后立即染色观察。此法主要用于临床快速诊断。对于生长在固体培养基上的微生物，可用白金环刮取，再用缓冲生理盐水稀释成悬液，即可滴样，待稍干后染色观察。对于生长在琼脂板上的噬菌体斑，也可采用直接取样法。（2）离心提纯法用于细菌、病毒、噬菌体等微生物或细胞匀浆中线粒体、微管等细胞器的提纯。先用低速离心(3000转/分)，弃去较大杂质和细胞碎片，再用适当孔径的滤膜过滤，其滤液再经低温超速离心，最后取沉淀物制成悬液滴样染色。（3）细胞培养取材法从培养瓶中刮下所培养的腺病毒或疱疹病毒，低速离心，弃上清液，于沉淀物中加入培养液与蒸馏水的混合液(比例为1：4)，使细胞因低渗破裂而释放出病毒，然后快速冻融数次，再将冻融后的悬液低速离心，取其上清液滴膜染色。（4）抗体-病毒凝集法某些病毒如鼻病毒、风疹病毒、小儿腹泻轮状病毒及甲、乙型肝炎抗原等，可与相应的抗体形成病毒-抗体复合物，经离心沉淀而浓缩，而后取浓缩的沉淀物滴膜染色，可找到较多的病毒。目前这一技术已广泛用于病毒疾病的快速诊断。几种具体应用①细菌培养物：可用白金丝接菌环在斜面培养基上刮取少许菌苔于双蒸水中配成悬液。若观察鞭毛，则用不超过24小时培养的新菌落，直接在培养物中加双蒸水，细菌自动游动悬浮起来便可以观察。②血清：血清需要等量的蒸馏水稀释，15000rpg离心除去上清中低分子蛋白，将沉淀用蒸馏水悬浮即可。③粪便：用蒸馏水制成10%的悬液，3000rpg离心15-30分钟，取上清15000rpg离心60分钟，稀释沉淀剂可负染。④尿液：取尿液5-10ml，3000rpg离心15-30分钟，取上清15000rpg离心60分钟，稀释沉淀剂可负染。若病毒量少，可取大量的尿液。⑤病毒性疱疹：最好选用未破裂的疱疹，用拉细的毛细管直接插入泡中，吸取泡液，直接滴在载网上负染。⑥脑脊髓液：取病人脑脊液少许，用双蒸水等量稀释后直接进行负染。⑦痰液：可用磷酸盐缓冲液进行1：4稀释，并用均浆器均浆，经3000rpg离心5-10分钟，再用15000rpg离心60分钟，取沉淀稀释后负染。⑧活组织：取病组织加缓冲液均浆，经3000rpg离心5-10分钟，再用15000rpg离心60分钟，取沉淀稀释后负染。组织刮取物：痂皮或结合膜细胞数量较少，加少许蒸馏水是细胞膜破裂，即可负染。（5）常用的负染色剂：①是磷钨酸（phosphotungsticacid,PTA）、磷钨酸钾（KPT）、磷钨酸钠（NaPT）。这是经常使用的几种负染色剂，适用于多数直接取样的样品和纯化样品，颗粒细腻、反差良好、图像背景干净杂质少。一般配制成1-3%的水溶液，PH值6.0-7.0使用。缺点是显示样品细节较差，对某些病毒有破坏作用。②醋酸铀是一种常用的优良负染色剂，能较好地显示病毒颗粒的细节，反差较强、对样品破坏小。一般用0.2-0.5%的水溶液，PH值4.5-5.5左右。③甲酸铀特别是用于螺旋对称的病毒颗粒。一般配制成0.5-1%的水溶液，临用前配制并调pH至5.5。④钼酸铵配制成2%~3％水溶液，使用时用醋酸铵将pH调至7.0~7.4之间。注：负染色液的PH值对负染的效果影响较大，一般偏酸的染液会得较好的效果，越是偏碱效果越差，碱性染液往往造成标本的凝聚变形。通常用的钨酸盐的PH值为6.0-7.0，比较获得较好的效果。（6）负染色的操作方法①滴染法：②漂浮法：③喷雾法应注意的问题：①负染的时机问题。②提纯的病毒最好1:10-1:100稀释。悬浮病毒的缓冲液也尽可能地稀释一些。③负染用的支持膜疏水性的处理。（用离子溅射仪处理）。④负染中常遇到颗粒悬浮样品的凝聚现象。办法可以通过2000-5000rpg离心和调节悬浮PH值到中性和偏酸性来解决。五、电镜冷冻制备技术应用：在细胞化学、免疫电镜、X射线微区分析以及可溶性物质的放射自显影研究等方面，均得到了比较广泛的应用。（一）过程。这一过程受样品含水量和水分存在的形式，冷冻速度、冷冻温度、细胞冷冻点和再结晶点的温差等因素的影响。（二）问题1、冰冻过程中冰晶形成及其后果。①冷冻的速度决定了冰晶的大小。300oCV/秒冰晶颗粒为100nm，500/秒为50nm，800oC/秒为30nm，最好104oCV/秒②冷冻温度因素决定了冰晶的形态。③细胞冷冻点与再结晶点温差的关系，控制着冰晶的成长。④冷冻固定的优点：避免化学反应；避免细胞变形；减少组织自溶的机会；电镜免疫鉴定。2、措施1）①选择合适的制冷剂，②特殊装置的使用2）防冷冻剂使用①醛类固定②5%-30%的甘油冷冻保护明胶甲基纤维素或牛血清蛋白分子包埋（四）冷冻制片过程1、冰冻超薄切片在低温下进行超薄切片.1)非固定样品的制备取材后快速冷冻和切片处理。优点：有利于保存生物材料中的可溶性物质以及生物大分子的活性和天然构型。此法适用于可溶性物质的放射自显影和X线显微分析研究。缺点:是不能得到很好的超微结构图像。2)固定样品制备法取材后用0.1M的二甲昆酸钠[（CH3）2·AsO.OnaSodiumcacodylate]缓冲的、2.5%戊二醛溶液固定一个小时，以保存大分子的结构和生物活性，然后进行冷冻保护处理。这种方法作出的标本适用于形态学、细胞化学和免疫化学的研究。其步骤大致如下①戊二醛固定