发酵工程下游加工工程

•第八章发酵工程下游加工工程•(downstreamprocessing)•第一节概述•一.重要性•1.产品分离纯化是最终获得商业产品的环节•2.发酵液是复杂的多相系统•2.生物产物的特殊特点：浓度、稳定性等•几种产品在发酵液中的浓度•产品典型浓度（g/L）•抗生素25•氨基酸100•酒精100•有机酸100•酶20•蛋白质10•4.投资费用高•抗生素、乙醇、柠檬酸占60%•纯化蛋白质80~90%•5.分离纯化技术落后会阻碍发酵工程技术的发展•5.上游要为下游创造条件•选育不产生杂质的菌种•胞内产物变为胞外产物•在细胞内形成包含体•给目的产物接上特殊“物质”•二.基本原理•根据混合物中不同组分分配率的差异将其分配于几个物相中，如溶剂提取、盐析、结晶等•或将混合物置于某一物相中（液相），使各组分分配于不同区域，如电泳、超离心、超滤等•三.一般程序•1.预处理和固液分离：加速固液相分离•2.细胞破碎分离胞内产物•3.初步纯化（提取）：除去与目的产物性•质差异很大的杂质•4.高度纯化（精致）：除去与产物性质相•似的杂质•5.产品加工•第二节发酵液的预处理和固液分离•一.预处理•分离菌体和其它悬浮颗粒•去除部分可溶性杂质•改变滤液的性质•（一）过滤特性的改变••产物浓度低1~10%•悬浮颗粒小•液相粘度大•性质不稳定•1.降低液体粘度•稀释升高温度•2.调节pH•改变某些物质电荷特性•3.凝聚与絮凝•改变细胞、细胞碎片及溶解大分子物质•的分散状态•4.加入助滤剂•不可压缩的多孔颗粒•硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠粉、白土、•炭粒、淀粉等•5.加入反应剂•消除杂质对过滤的影响•新霉素发酵液中加入氯化钙和磷酸钠•磷酸钙：助滤剂，使某些蛋白质凝固•（二）去除高价无机离子•1.Ca2+、Mg2+、Fe2+等影响树脂的交换容量•2.用草酸去除钙离子，草酸钙还能促进蛋•白质凝固•3.三聚磷酸钠与镁形成可溶性络合物•Na5P3O10+Mg2+=MgNa3P3O10+2Na+•4.黄血盐与铁离子形成普鲁土盐沉淀•3K4Fe(CN)6+4Fe3+=Fe4[Fe(CN)6]3+12K+•（三）去除可溶性杂蛋白•1.蛋白质等电点沉淀•两性物质，稳定性与所带电荷有关•酸性溶液中带正电荷，碱性中带负电荷•2.酸性溶液中与阴离子物质结合形成沉淀•三氯醋酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味•酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等•3.碱性溶液中与阳离子形成沉淀•Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Pb2+等•4.盐析•亲水胶体，加入碱金属中性盐，脱水剂•5.热变性•一般蛋白质在70~80C发生不可逆变性•如链霉素发酵液在pH3.0，加热到70C保•持0.5h后过滤•柠檬酸发酵液在80C处理•6.加入絮凝剂•7.吸附作用•（三）去除色素及其它物质•1.色素产生•微生物生长代谢产生，培养基带来•2.去除方法•离子交换剂、离子交换纤维、活性炭等吸附•如DEAE-纤维素从含酶溶剂中吸附色素物质时，可同时去除非活性蛋白质•二.发酵液固液分离•（一）离心•（二）过滤•菌种对过滤速度影响很大•真菌容易过滤，放线菌则难•培养基组成对过滤也有影响•第三节微生物细胞破碎•一.微生物细胞壁的组成与结构•微生物种类，培养基组成影响细胞壁•二.常用细胞破碎方法•1.珠磨法（beadmill）•实验室：Mickle捣碎机、匀浆器Braun•中试：胶质膜处理•工业：高速珠磨机（High-speedbeadmill）•2.高压匀浆法（Highpressurehomogenization）•大规模细胞破碎方法•高压匀浆器•对于酵母等难破碎及高浓度细胞可采用多•次循环方法•丝状真菌、较小的G+菌，含有包含体（Inclusionbody）的基因工程菌不宜用此•法•3.超声波破碎（Ultrasonication）•杆菌比球菌容易破碎•G-比G+容易破碎•酵母菌不易破碎•实验室较常用的方法，样品温度？？•4.酶溶法（Enzymaticlysis）•lysozymeproteasecellulasezymolyase•价格高，通用性差，产物抑制的存在•自溶法（Autolysis）•5.化学渗透法（chemicalpermeation）•改变细胞壁或细胞膜的通透性•TritonX-100：结合、溶解磷脂，破坏膜脂•双层•EDTA：对G-菌外膜有破坏作用•有机溶剂：分解细胞壁中的脂类•变性剂：脲、盐酸胍与水中氢键作用•优点：选择性，易于固液分离•缺点：通用性差，效率低，毒性•6.其他方法•X-press法•渗透压法（osmoticpressure）•反复冻溶法•多种方法结合•与上游过程结合•与下游过程结合