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11第二章发酵过程的生物学基础22本章的教学内容第一节发酵过程与微生物第二节微生物的营养与培养基的设计第三节微生物的生长模式及其动力学第四节环境对微生物的影响第五节代谢产物的代谢调控第六节微生物代谢产物的过量产生33第一节发酵过程与微生物第一节发酵过程与微生物k.微生物与发酵k.微生物细胞工厂44一、微生物与发酵•发酵工程是以微生物的生命活动为中心的•微生物的生物学性状和发酵条件决定了其相应产物的生成•工业上用的全部微生物都称为工业微生物，工业生产上常用的微生物主要是细菌、放线菌、酵母菌和霉菌•由于发酵工程本身的发展以及基因工程正在进入发酵过程，病毒、藻类等其它微生物也正在逐步地变为工业生产菌。55二、微生物细胞工厂裂解生物燃料C1-C6平台化合物高分子聚合物芳香族化合物C2酸C2醇C2CoAC3酮酸C2醛C2~P转移ADPATP还原NADHNAD+氧化Pi+O2CO2还原NADHNAD+C1酸氧化CO2NADHNAD+转移C3酮酸~PC3酸~P转移裂解H2OC3醛~P异构NAD+NADHADPATP转移氧化ADPATPC3羟酮~P异构C3二醇裂解NADHNAD+还原ADPATP转移NADHNAD+还原H2O生物质粗原料C6糖~P裂解转移ADPATPC5糖~PC7糖~PC4糖~P转移ADPATP转移转移还原NADPHNADP+苯C3酮酸裂解异构C3羟酸还原裂解C3烯酰CoANADHNAD+裂解C3烯酸氧化CO2H2合成C4CoAC3酮C3醇裂解还原还原NADHNAD+C4醇聚酮合成转移聚羟基烷酸C4酸C6酸C5酮酸C4CoA合成CO2转移氧化NAD+NADHCO2氧化CO2合成六碳糖(葡萄糖甘露糖)五碳糖(木糖、阿拉伯糖)转移分解酶系水解水解将生物质原料各类组分，高效、定向合成燃料、材料与各类化学品66减压精馏氧化氧化丙烯酸建筑、纺织、包装目前国内需求55万吨，产值88亿生物质生物炼制细胞工厂细胞工厂的生产模式实现One-Pot反应，缩短石油化学品生产的工艺流程，减少原油资源消耗，降低投资成本，减少污染与CO2排放。分离裂化分离分离分离y选择性y高效性y含氧原料y手性特征3-羟基丙酸石油77“微生物细胞工厂”概述•所谓“工厂”，就是能够生产或制造某种产品，或者进行某种处理程序的场所。因此,一般意义上的“工厂”应该具备特定的生产线，以及相应的动力等辅助系统，并且需要在一定的管理程序下才能正常运转，尤其重要的是“工厂”的各要素是根据人的意志“设计”进行的，可以根据需求设计生产线及辅助系统等，并调控生产进度。•“细胞工厂”也具备相应的组成要素，同样地，对于“细胞工厂”而言，其“可设计性”也是昀重要的。这就首先需要了解菌体的遗传操作背景及原有的代谢途径或网络，因此细胞工厂的构建多在遗传背景相对清楚的模式菌的基础上进行。88“微生物细胞工厂”概述在遗传背景相对清楚的模式菌中构建新的代谢途径或进行代谢调控根据需求设计生产线,并调控生产进度胞内复杂的调节控制系统和对外界调控的响应能力管理程序胞内能量及辅因子系统动力等辅助系统产物合成/底物降解途径生产线相应的细胞结构或调控要素“工厂”组织和调控要素99“微生物细胞工厂”概述•野生型的菌株通常不能被称之为细胞工厂，主要是因为：–野生型菌株代谢速率和产物积累浓度低;–野生型菌株的代谢产物往往是多种产品的混合物，直接用于工业生产时产品分离难度较大;–野生型菌株主要依靠自然进化，速度慢，随机性强，不适合用于工业生产;–多数微生物底物谱较窄，而生物质成分复杂，难以被一种微生物全部利用。1010细胞工厂的挑战细胞工厂的挑战复杂原料大量合成定向合成微量合成不能合成木糖阿拉伯糖半乳糖甘露糖葡萄糖(淀粉)产品合成能力精细原料目前生物炼制的经济竞争力与市场影响力有限原料利用能力葡萄糖时间浓度(g/L)100木糖利用速率:葡萄糖1/4转化率:10-40%木糖微生物产量(g/L)130~150时间乙烯(?)3-羟基丙酸(?)丙烯酸(?)丁二酸乙醇谷氨酸柠檬酸丁醇1111细胞工厂的构建遗传修饰设计策略代谢分析出发菌株细胞工厂高效利用生物质高效生产目的产物细胞工厂构建的策略1212细胞工厂的构建•基于基因组序列数据、代谢组分析和通量组计算重构代谢网络，是构建生物炼制细胞工厂的基础。•在此基础上，利用计算生物学的方法，整合转录组学、蛋白质组学和代谢组学所产生的数据，理解微生物对不同的细胞内和环境刺激的应答情况，利用适当的算法解析代谢网络结构，确定其中的关键节点，可以设计出新的代谢工程策略，设法调节代谢流向目标产物产量昀大化的方向流动，从而构建高效的细胞工厂。1313第五节微生物的代谢调节在生物进化过程中，微生物细胞形成了愈来愈完善的代谢调节机制，在代谢繁殖过程中，能量的利用以及对细胞生长繁殖过程中所需的各种物质的形成是非常合理和经济的，细胞经常处于平衡生长状态，不会有代谢产物的积累。1414现代发酵工业要研究的主要内容就是通过改变培养条件和遗传特性，使微生物的代谢途径改变或代谢调节失控而获得某一发酵产物的过量产生。其方法大体可分为两类：–改变产生菌的基因型而改变代谢途径；–改变控制代谢速率，即影响基因型的表达。1515¾代谢调节(regulationofmetablism）是指微生物的代谢速度和方向按照微生物的需要而改变的一种作用。酶量的调节酶活性的调节1616¾微生物代谢的控制是指运用人为的方法对微生物的代谢调节进行遗传改造和条件的控制，以期按照人们的愿望，生产有用的微生物制品。17179代谢调节的方式9酶合成的调节9酶活性的调节方式9初级代谢的调节9次级代谢的调节1818一、代谢调节方式¾细胞透性的调节¾代谢途径区域化¾代谢流向的调控¾代谢速度的调控19191，细胞透性的调节¾细胞质膜的透性直接影响物质的吸收和代谢产物的分泌，从而影响到细胞内代谢的变化。¾细胞质膜的透性的调节是微生物代谢调节的重要方式，由它控制着营养物质的吸收和产物分泌。代谢调节方式2020•例如，大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌吸收乳糖是由渗透酶和环状AMP(cAMP)协同控制来完成的。cAMP的浓度是由腺苷酸环化酶(AC)的活性控制的，也就是说，乳糖的吸收受渗透酶和AMP环化酶的控制，调节蛋白通过磷酸化的形式和腺苷酸环化酶（AC）或渗透酶结合，分别使腺苷酸环化酶活化或使渗透酶失活。当有葡萄糖时，乳糖的渗透酶以无活性状态存在，而腺苷酸环化酶也以非活性状态存在。代谢调节方式2121LL--异亮氨酸的膜渗透情况异亮氨酸的膜渗透情况BrnEBrnFBrnQ代谢调节方式22222，代谢途径区域化¾原核微生物细胞结构虽然简单，但也划分出不同的区域，对于某一代谢途径有关的酶系则集中某一区域，以保证这一代谢途径的酶促反应顺利进行，避免了其他途径的干扰。–例如呼吸的酶系集中在细胞质膜上；而与蛋白质合成有关的酶系则位于核蛋白体上；分解大分子的水解酶，在革兰氏阴性菌里是位于壁膜间隙中，而革兰氏阳性菌则将这些水解酶类，分泌于胞外。代谢调节方式2323¾在真核微生物细胞里，各种酶系被细胞器隔离分布。如与呼吸产能有关的酶系集中于线粒体内膜上；蛋白质的合成酶系位于核蛋白体上；DNA合成的某些酶位于细胞核里。代谢调节方式2424¾细胞具有复杂的膜结构使其代谢活动只能在特定的部位上进行，即代谢活动是区域化的，其实质是控制酶与底物接触，使各个反应有序地进行。代谢调节方式2525线粒体:丙酮酸氧化;三羧酸循环;β-氧化;呼吸链电子传递;氧化磷酸化细胞质:酵解;磷戊糖途径;糖原合成;脂肪酸合成;细胞核:核酸合成内质网:蛋白质合成;磷脂合成酶定位的区域化代谢调节方式26263，代谢流向的调控¾微生物在不同条件下可以通过控制各代谢途径中某个酶促反应的速率来控制代谢物的流向，从而保持机体代谢的平衡。它包括两种形式由一个关键酶控制的可逆反应由两种酶控制的逆单向反应代谢调节方式2727•由一个关键酶控制的可逆反应同一个酶可以通过不同辅基(或辅酶)控制代谢物的流向。–例如，谷氨酸脱氢酶以NADP+为辅酶时，主要是催化谷氨酸的合成，当以NAD+为辅酶时，则催化谷氨酸的分解。因此微生物可以通过不同的辅基来控制代谢物的流向。代谢调节方式2828•由两种酶控制的逆单向反应逆单向反应是在生物体代谢的关键部位的某些反应，它是由两种各自不同的酶来催化的。即在一个“可逆”反应中，其中一种酶催化正反应，而另一种酶则催化逆反应。–例如，葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖是由己糖激酶催化的，而其逆反应则是由6-磷酸葡萄糖酯酶催化的。6-磷酸果糖转化为1，6-二磷酸果糖是由磷酸果糖激酶催化的，逆反应则由1，6-二磷酸果糖酯酶催化。代谢调节方式29294，代谢速度的调控¾在不可逆反应中，微生物通过调节酶的活性和酶量来控制代谢物的流量。¾微生物在不同条件下能按照需要，通过激活或抑制原有酶的活性或通过诱导或阻遏酶的合成来自我调节其代谢速度，使之高度经济有效地利用能量和原料进行生长繁殖。代谢调节方式3030二、酶合成的调节•酶合成的诱导•酶合成的阻遏31311，酶合成的诱导酶合成的调节32322，酶合成诱导的机制酶合成的调节33333，酶合成的阻遏酶合成的调节34344，酶合成阻遏的机制酶合成的调节3535三、酶活性的调节概念¾酶活性调节是指一定数量的酶，通过其分子构象或分子结构的改变来调节其催化反应的速率。影响因素¾底物和产物的性质和浓度¾环境因子(如压力、pH、离子强度和辅助因子等)¾其他的酶的存在调节方式¾激活已有酶的活性¾抑制已有酶的活性3636（一）激活¾激活：在激活剂的作用下，使原来无活性的酶变成有活性，或使原来活性低的酶提高了活性的现象。¾代谢调节的激活作用：主要是指代谢物对酶的激活。前（体）馈激活，指代谢途径中后面的酶促反应，可被该途径中较前面的一个中间产物所促进。代谢中间产物的反馈激活，指代谢中间产物对该代谢途径的前面的酶起激活作用酶活性的调节3737反馈激活和前（体）馈激活示意图A→B→C→D→FA→B→•••••→GCDEE+++例1：糖代谢途径中丙酮酸积累激活丙酮酸羧化酶例2：乙酰CoA的积累激活PEP羧化酶3838酶的反馈激活葡萄糖草酰乙酸丙酮酸羧化酶乙酰CoA活化磷酸烯醇式丙酮酸拧檬酸α-酮戊二酸1，6-二磷酸果糖3939（二）抑制¾抑制：由于某些物质的存在，降低酶活性的现象。¾反馈抑制（feedbackinhibition）：反馈抑制是指代谢的末端产物对酶(往往是代谢途径中的第一个酶)活性的抑制。无分支代谢途径的调节有分支代谢途径的调节酶活性的调节40401，无分支代谢途径的调节¾通常是在线形的代谢途径中末端产物对催化第一步反应的酶活性有抑制作用。酶活性的调节4141•例如，在大肠杆菌中，由苏氨酸(Thr)合成异亮氨酸(IIeu)时，异亮氨酸对催化反应途径中的第一步反应的苏氨酸脱氨酶(TD)有抑制作用。苏氨酸α-酮丁酸异亮氨酸TD酶活性的调节42422，有分支代谢途径的调节¾在有两种或两种以上的末端产物的分支合成代谢途径中，调节方式较复杂，其共同特点是每个分支途径的末端产物控制分支点后的第一个酶，同时每个末端产物又对整个途径的第一个酶有部分的抑制作用，分支代谢的反馈调节方式有多种:顺序反馈抑制（sequentialfeedbackinhibition）同工酶的反馈抑制（isoenzymefeedbackinhibition）协同反馈抑制（concertedfeedbackinhibition）累积反馈抑制（cumulativefeedbackinhibition）超相加反馈抑制（cooperativefeedbackinhibition）酶活性的调节4343（1）顺序反馈抑制sequentialfeedbackinhibition¾分支代谢途径中的两个末端产物，不能直接抑制途径中的第一个酶，只有当两个末端产物都过量时，才能对途径中的第一个酶有抑制作用。酶活性的调节4444•例如，枯草杆菌在芳香族氨基酸合成中，色氨酸(Try)抑制邻氨基苯甲酸合成酶(AS)，苯丙氨酸(Ph