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发酵工程制药第一节：微生物细胞工程（发酵工程制药）生产原理第二节：利用微生物进行药物的生产实例一、发酵生产过程•生产用菌种--------•原始材料--------•培养基------•程序-------•生产细则-------•以青霉素为例讲解（1）青霉素（penicillin）•所用菌种---黄青霉菌•原始材料---α-氨基已二酸、半胱氨酸、缬氨酸。•发酵方法----加前体物质的深层发酵法。•青霉素发现者弗莱明沙土管菌种↓转移到固体琼脂斜面培养基上，24℃培养5-6天，获得芽孢↓芽孢悬浮于无菌水中，进行摇瓶培养↓进入移种瓶培养↓进种子罐，接种量为5%-10%↓进繁殖罐，28℃培养48-96小时↓进入发酵罐，开始生产。↓鼓式过滤↓第一次萃取器↓纯化柱↓第二次萃取器↓第三次萃取器↓真空结晶釜↓瓷过滤器↓结晶洗涤釜↓真空干燥器（结束）•程序•（1）使用消沫剂，由于发酵过程中产生大量的CO2，会产生大量泡沫。可采用植物油、豆油、合成消沫剂进行消沫处理。•（2）温度控制在24-30℃、PH值控制在6.8--7.2。•（3）应该注意控制残糖量、还原糖量、PH值、氨、氮、溶解氧量。•（4）发酵过程中要注意通气搅拌，所通入的空气必须是无菌的。•（5）发酵罐必须保持正压（20-30kPa），以防罐外不洁净的空气流入。•（6）目前国际上青霉素发酵的水平已经达到8万多单位/ml，相当于50g/L。•生产细则二、灭菌技术•灭菌操作是为了保证杂菌不进入工业发酵系统。•（一）灭菌项目•（二）灭菌方法•（三）灭菌的矛盾之处•（四）具体的灭菌技术（一）灭菌项目•1、在投入生产之前，必须对设备、管道进行彻底清洗、和严格灭菌。•2、对通入的培养基、通入的空气进行先行灭菌。（二）灭菌方法•2、化学法1、加热法3、辐射法4、过滤法（三）灭菌的矛盾之处•对杀灭细菌的同时•1、培养基中的营养成份也随之遭到分解和破坏。•2、杀死杂菌的同时也杀死了工程细菌。（四）具体的灭菌技术•可分为6种技术：•1、间歇灭菌法•2、加热灭菌法•3、连续灭菌法•4、空气加热灭菌法•5、空气过滤灭菌法•6、营养物质瞬时高温杀菌法1：间歇灭菌法•又称为分批灭菌，是指将培养基放在发酵罐内，然后连罐加热到规定的灭菌温度。•（1）灭菌方法•（2）注意事项•（3）间歇灭菌法的优点（1）灭菌方法•间歇灭菌的操作过程分为3个过程：•加热----保温维持----冷却。•这些不同的阶段，均能够起到灭菌的作用。然而，在灭菌过程中，保温杀菌的作用是主要的，冷却杀菌的作用最小。（2）注意事项•应当避免过长的加热时间，否则常常会破坏培养基中的营养物质。•系统经过灭菌操作之后，必须达到不留1个杂菌，否则，只要经过1昼夜的增殖，1个杂菌就会增加到272个杂菌，最后会导致整批发酵液的失败。（3）间歇灭菌法的优点•设备造价低廉。•便于进行手动操作。2：加热灭菌法•隧道灭菌箱设备3：连续灭菌法•（1）定义•（2）技术分类•（3）连续灭菌法的优点•（4）连续灭菌法的不足（1）定义•连续灭菌法是指灭菌的操作的加热、保温维持、冷却这三个过程，在同一时间内进行。•因此，在连续灭菌系统中，需要分别设置加热设备、保温维持设备、冷却设备。（2）技术分类•连续灭菌法可以分为2种：•（1）加热、冷却缓慢交替进行方法。•（2）迅速升温+闪急冷却方法-----这种方法称为HTST方法，这对于保证营养物质极为有利。（3）连续灭菌法的优点•（1）可减少培养剂中营养物质的损失、提高产物收率。•（2）由于操作条件恒定，可以获得稳定的灭菌质量。•（3）容易实现自控操作。•（4）能够避免系统的反复加热和冷却，可提高热利用率。是目前很多制药厂经常采用的方法。（4）连续灭菌法的不足•（1）投资较大，•（2）需要同时设置加热、冷却装置。4：空气加热灭菌法•利用空气压缩时产生的高温，使得微生物体内的蛋白质变性，而达到杀菌目的，这种方法称为空气加热灭菌法。•不同温度下的空气细菌存活时间：200℃/15.1s，250℃/5.1s，300℃/2.1s，350℃/1.05s。•干热杀菌的流程通常是：先采用废热，将空气预热到60-70℃，然后进入压缩机压缩，并在200℃以上的温度维持一段时间。以便杀死杂菌，然后再进入发酵罐之中。5：空气过滤灭菌法•是指让空气通过过滤介质，以阻截空气中所含的微生物，取得无菌空气的目的。空气过滤分为2种：（1）绝对过滤（2）深层过滤•陶瓷过滤机（1）绝对过滤•如超滤膜过滤就属于绝对过滤•是指所用滤膜的孔径小于空气中的固体颗粒。从而把颗粒截留。（2）深层过滤•是凭借滤层内的曲折通道，而将颗粒截留的方法。它不要求滤膜的孔径小于空气中的固体颗粒。这是目前发酵工业常用的过滤除菌方法。•深层过滤所用的过滤介质-------棉花、活性碳、玻璃纤维、合成纤维、各种有机或无机的烧结材料（烧结金属、烧结陶瓷、烧结塑料、蒙乃尔合金粉烧结板）、超细玻璃纤维、超细玻璃纤维过滤纸，微孔聚合物（聚乙烯醇PVA过滤板、PVA烧结板等已经在日本的发酵工业中广泛应用）。6：营养物质瞬时高温杀菌法•一般来说，当温度升高时，微生物死亡速率的增加营养物质遭到破坏的速率。•因此，对于瞬时的高温，细菌常常被杀死，而营养物质则破坏得不多。•根据这一原理，可以采用营养物质瞬时高温杀菌法进行杀菌操作。三、分离纯化技术•微生物的发酵产物是一种混合物，里面除了含有主要产物以外，还含有未能转化的基质和底物、残余的原料、大量的水、微生物细胞、各种杂质。因此，必须对发酵产物进行分离和纯化。•分离和纯化过程被称作“下游加工过程”，需要经过以下这几个阶段：（一）固体物质的去除，（二）初步分离，（三）产品提纯，（四）产品的最终分离。（一）固体物质的去除•1、目的•2、常用的方法有•3、常用的设备4、固体物质的前期预处理技术1、目的•（1）分离出完整的细胞。•（2）将细胞进行溶菌处理，提取细胞内的生物产品。•（3）除去细胞有残留碎片。•（4）除去没有转化的不溶性基质。•（5）一部分细胞返回到反应器内，进行再循环操作。2、常用的方法•（1）过滤法------分批过滤、连续真空过滤、错流流动过滤。错流流动过滤法------使液体平等于过滤膜的表面进行流动，这样能够不断地移去在滤膜表面积累的细胞物质，从而获得近似于恒定的过滤速率。•（2）离心分离法------垂直式离心、水平式离心。•（3）沉降法------与一般的自由沉降不同，工业生产过程的沉降都属于干扰式沉降。3、常用的设备•（1）过滤设备------板框过滤机、回转真空过滤机•（2）离心设备-------转篮式离心过滤机（三足式离心过滤机）、刮刀卸料式离心过滤机、沉降式离心过滤机、喷雾离心过滤机、间断排料式离心过滤机、倾析式离心过滤机。•（3）沉降设备------管式离心沉降机。4、固体物质的前期预处理技术•由于生物反应液的粘度很大，直接分离往往比较困难，因此，常常对其进行预先的前期处理，来提高分离效果。•常见的预处理技术有：（1）使细胞老化凝聚成团，（2）加热，（3）改变PH值，（4）添加化学物质促进凝聚，如加入高分子电解质、氯化钙、胶态粘士。（二）初步分离•进一步把已经分离的溶液浓缩，提高目的产物浓度的方法，称为初步分离。•初步分离的具体方法可以分为：•1、蒸发•2、萃取•3、沉淀•4、膜分离1、蒸发•蒸发是通过加热，使溶液中的水经过汽化除去要提高溶质浓度、为溶质的析出创造条件的一种操作方法。•各种代谢物，如氨基酸、抗生素、酶都可以进行蒸发操作。•由于生物产品大多数是热敏性物质，所以物料在蒸发器内的停留时间必须尽可能短，同时，还应该昼避免局部液体过热。•LG系列离心式刮板薄膜蒸发器示意图•蒸发设备（1）连续流动膜式蒸发器，（2）长管膜式蒸发器，（3）强制膜式蒸发器，（4）离心膜蒸发器。2、萃取•萃取是通过物质在2种溶液之间不同的溶解度，来实现分离的操作方法。•萃取的分类•（1）有机溶剂萃取•（2）双水相萃取（1）有机溶剂萃取•许多抗生素都能够溶解在有机溶剂之中，如乙酸乙酯、乙酸丁酯、因此，通过萃取，可使得抗生素从水相进入有机相之中，从而实现分离。•由于抗生素在有机溶剂之中极不稳定，因此，在保证萃取效率的前提条件下，必须尽量缩短操作时间。•有机溶剂萃取设备可使用Podbielniak离心萃取机。•SFT-150超临界萃取反应仪•利用萃取法来提取抗生素，具有质量好、收率高、速度快的优点。•双水相萃取法，目前用于进行酶、和蛋白质的提取工艺。（2）双水相萃取•使用2种互不相溶的高聚物，如聚乙二醇（PEG）、葡聚糖，分别将它们溶于水中形成双水相，利用目的产物在双水相中不同的分配系数而实现分离的方法，称为双水相萃取。•萃取之后的目的产物可以通过超滤法进行提纯。•双水相萃取材料--------（1）PEG--葡聚糖萃取系统，（2）PEG—磷酸钾萃取系统。3、沉淀•蛋白质在溶液中具有“等电点”的特性，而且其等电点与溶液PH值有关，PH值大，蛋白质呈负电，PH值小，蛋白质呈正电，当PH=pI（等电点）时，蛋白质不带电荷。•蛋白质在PI时的溶解度最小。这是因为蛋白质在水中有均匀分布是由于同性电荷相斥的缘故，当PH=pI时，由于蛋白质分子不带电荷，于是开始相互凝聚、产生沉淀。•NSG-630浓缩分离机•ZHN系列真空浓缩罐沉淀和盐折的结合•由于沉淀常常导致蛋白质变性而失效。而利用盐溶液就能避免蛋白质的变性，这种方法就称为------盐析法。•在不同的盐溶液之中，蛋白质有盐析效应有所不同。按下列顺序递减：（1）阴离子------柠檬酸盐-3、酒石酸盐-2、SO4-2、F-、IO3-、H2PO4-、醋酸盐-、B2O3-、Cl-、ClO3-、Br-、NO3-、ClO4-、CNS-。（2）阳离子-------Th+4、Al+3、H+、Ba+2、Sr+2、Ca+2、Mg+2、Rb+、NH4+、K+、Na+、Li+。•从离子物性来看，硫酸铵并不是盐析效应最强的盐类，但是由于它在水中的溶解度极大，对盐析十分有利，因此硫酸铵是目前最常用的盐析剂。4、膜分离•膜分离技术是基于一种半透性薄膜，它能够使得溶液中的某些组分通过，而阻止和截留其它组分的分离方法。•膜分离的优点（1）由于膜分离是纯粹物质粒度大小这一几何特性来进行分离，它不必象萃取、沉淀法那样需加入其它化学物质、也不必象蒸发那样进行加热。因此，产物的生物学特性能够得到完好的保存，（2）产物的损失量很少，有利于提高得率。•膜分离的分类•（1）反渗透法•（2）超滤法（1）反渗透法•根据物理化学的原理，当含有溶质A的溶液B与另一渗透液C之间被半透膜隔开的时候，由于系统渗透压的作用，渗透液C便会进入到溶液B之中，这种现象称为渗透现象。形成这种渗透的压力就自然称为渗透压（π）•如果在溶液B一方施加压力（⊿P），发现渗透液C进入溶液B的速率就会减小。当压力（⊿P）=渗透压（π）时，渗透现象就会停止。•当压力（⊿P）渗透压（π）时，就会看到溶液B开始反向进入渗透液C之中，这种现象就称为反渗透现象。•根据溶液所具有的反渗透特性，可以实现溶液的浓缩。（2）超滤法•是指在反渗透的基础之上，将隔离膜由原来的半透膜，改成带有较大孔径的薄膜。这样一来，在反渗透操作过程中，不但是溶剂进入到渗透液之中，就连那些许多小分子的杂质也连带一起进入到渗透液之中。•与反渗透法相比，超滤法明显具有其优点-------反渗透法只能起到浓缩作用，而超滤法在浓缩的同时，还具有纯化作用。反渗透法+超滤法的实际应用•（1）主要用于蛋白质溶液的浓缩、脱盐等步骤，（2）在疫苗、血浆等生产中也常被使用。膜分离装置的分类（1）中空纤维束，（2）板-框膜分离装置，（3）螺旋状膜分离装置•反渗透装置（三）产品提纯•层析法，是指在一根层析柱内，填充某种特殊的载体物质，称为固定相。含有待分离产物的溶液则称为流动相。当流动相流过固定相的时候，由于流动相中不同的物质与固定相之间产生了不同强度的结合力，因此各种物质在层析柱内停留的时间也各不相同，结果，它们将依次序的先后流出层析柱。•层析法的