1发酵工程的研究状况和进展陈坚江南大学jchen@jiangnan.edu.cn2发酵工程的研究状况3生物质原料化学品-精细化学品-大宗化学品-食品添加剂-生物塑料-溶剂-酚类-粘合剂-脂肪酸-碳黑、颜料-燃料、香料、墨水-洗涤剂生物能源-生物酒精-生物柴油-甲醇-氢气-沼气工业生物技术主要部分--发酵工程4发酵:生物反应过程上游加工过程加工过程下游成本经济学原料的生物具有应用价值目的产物大规模工艺开发传统诱变、分子生物学、组学发酵工程广义的发酵概念:生物学(微生物学、生物化学)和工程学(化学工程)结合。狭义的发酵概念:微生物培养和代谢过程。t0.40.81.21.62.0123Eqs/h-1t/h00.10.20.30.40102030405060123Fqp/h00.20.40.60.8m/h-1123-1D微生物生长底物消耗产物生成5获得应用价值的微生物反应器及过程放大发酵过程优化和控制发酵工程研究发酵产物分离提取6发酵工程的关键问题和工程意义微生物能够积累最大目的产物(产量)的条件是什么?高产量便于产品分离提取关键问题1工程意义1相关:微生物生理、遗传特性和营养、环境因素7底物最多被微生物转化为产物(转化率)的条件是什么?粮食原料为底物高转化率降低原料成本关键问题2工程意义2相关:微生物代谢途径和过程条件发酵工程的关键问题和工程意义8微生物最快速度发酵生产目的产物的条件是什么?分批操作为主高生产强度缩短生产周期工程意义3关键问题3相关:微生物反应动力学和系统优化发酵工程的关键问题和工程意义9条件确定过程优化初始条件过程分析过程强化发酵优化的研究思想:发酵是一个过程10基于细胞表观特性进行优化0481216t/hd(DCW)/(g/L)A020406080100120140t/hr(Glucose)/(g/L)B02040608001020304050607080t/hr(Pyruvate)/(g/L)C基于细胞内部分析进行优化高产量高底物转化率高生产强度优化策略在理论和技术上有突破,在工业生产中能广泛应用显著提高发酵过程的经济性和科学性研究方法111基于微生物反应原理的培养环境优化技术优化微生物生长的物理和化学环境保证微生物生长处于最适条件基本思想奠定基础基于底物运输、生化反应、产物排出确定不同环境条件对微生物生长和代谢产物分布的影响Prod.Distribution发酵优化12●培养基组成的优化技术●发酵环境条件的优化技术●确定培养基组分的最小用量,避免底物的过量或不足●减少副产物的形成,使底物转化率明显提高●对关键物质的浓度及其供给方式进行优化,使目标产物产量明显提高●分析不同环境条件下微生物的生理学目的内容132基于微生物代谢特性的分阶段培养技术研究思想控制环境条件在最适合细胞生长或最适合产物合成的水平。目的分析不同T、pH、RPM、DO发酵过程的动力学参数(μ,qp,qs)流变学参数的变化特性分阶段控制策略提出分阶段T、pH、RPM、DO发酵优化14利用分阶段培养技术还可以将细胞生长期和产物形成期人为分开,从而实现优化发酵过程的目的。T,pH,DO,RPM153基于反应动力学和人工智能的优化和控制技术研究思想建立动力学模型,求解参数并评价其适用性对发酵进程和产量指标进行预测•Model•Form•Monod•Constantyield•u=umaxs/(Km+s)•Yx/s=Y0•Substrateinhibition•Constantyield•u=umaxs/(Km+s+s2/Ki)•Yx/s=Y0•Substrateinhibition•Variableyield•u=umaxs(1-–T.s)/(Km+s+s2/Ki)•Yx/s=Y0(1-–T.s)/(1+R.s+G.s2)•Substrateandproductinhibition•Inhibitions•Constantsyields•u=umaxs/(Km+s+s2/Ki)•u=umaxo(1-–P/Pm)•qp=alpha.u+beta•alpha,betaandYp/s以数学模型为基础的优化优化发酵过程发酵优化16以生理模型为基础的优化采用人工神经网络、专家系统、模糊逻辑控制技术对发酵过程进行在线状态预测和模式识别自适应最优化控制系统的开发、计算机模拟和实际应用174基于代谢通量分析的过程优化技术研究思想参考已知的生化反应计量关系、代谢途径、生理、特征,构建、合成不同产物的代谢网络。利用代谢通量分析方法,计算得出胞内各条代谢途径的通量变化。发酵优化18分析不同发酵产品合成途径中主要代谢节点的性质,结合发酵过程中胞内能量代谢情况,提出一系列发酵优化策略。目的19长期胁迫-可遗传性的应答(遗传变异)短期胁迫-不可遗传性的应答(生理性的)PyruvateNAD+NADHADPATPethanolAnaerobicAerobicMitochondrionATP环境压力或胁迫饥饿、高温、高压、机械剪切、冷冻、强酸、强碱、高渗透压(高盐)、活性氧、有毒化学物质等等细胞结构、基因转录和蛋白表达的临时改变,酶原的激活以及代谢途径的临时调整等5基于环境胁迫条件下微生物生理应答的过程优化技术发酵优化20研究一些重要的工业微生物的抗胁迫因子及其抗胁迫机制,考察环境胁迫条件下特定微生物蛋白转录和代谢途径变化,采用不同环境胁迫手段或措施对微生物的生长或代谢进行调控,促进微生物生长或大量合成目的产物。学术思想21学术思想6基于微生物代谢的辅因子调控的过程优化技术CofactorsMetalionsNADH/NAD+NADPH/NADP+ATP/ADP/AMPCoA/Acetyl-CoAVitamins发酵优化研究辅因子形式及其浓度在物质代谢和信号传递途径中控制代谢流方向和流量分配的作用机制、物质流和辅因子流的变化规律,对微生物的生长或代谢进行调控,促进微生物合成目的产物的代谢流的最大化和快速化。22蛋白质组学组学Discovery-driven转录组学代谢组学通量组学DNA芯片技术二维电泳/质谱技术多维色谱/质谱技术同位素-核磁共振技术计算生物学基因组模型化技术实验生物科学Hypothesis-driven分子遗传学分子微生物学蛋白质工程结构生物学代谢工程重组DNA技术蛋白质结晶及晶体衍射技术酶的定向进化技术高通量筛选技术微生物生理学反向代谢工程技术细胞功能认识和优化生物学知识和技术发酵工程的未来23工程学方法和规律工业生物过程细胞群体效应生化、生理特性分析物质和能量传递模型过程放大原理和策略发酵优化系统全局优化与集成过程优化细胞群体效应调控的直接放大生物/化学方法级联的系统优化多产物联产目标的全局调控发现和认识创新技术和方法集成优化细胞群体单元过程系统优化反应/分离单元耦合集成生物/化学级联方法多目标联产方法耦合技术基于生理特性的直接放大过程集成发酵工程的未来24发酵工程研究举例25举例1:丙酮酸发酵GlucosePyruvateAlanineAcetaldehydeEthanolCitrateOAA-KGAcCoAPyruvateOAAPDH(B1,NA)PDC(B1)PT(B6)PC(Bio)B1:硫胺素NA:烟酸Bio:生物素B6:吡哆醛GlucosePyruvate光滑球拟酵母中丙酮酸代谢途径如何得到丙酮酸高产量发酵?--菌株选育和培养条件优化XXXX选育自身不能合成维生素的酵母(维生素缺陷型)控制培养基中维生素浓度LiY,ChenJ,LunS.Appl.Microbiol.Biotechnol.2001,55:680-685,57:471-479.LiY,ChenJ,LiangD,LunS-Y.J.Biotechnol.2000,81:27-3426t0.40.81.21.62.0123Eqs/h-1t/h00.10.20.30.40102030405060123Fqp/h00.20.40.60.8m/h-1123-1D动力学分析高溶氧下,丙酮酸转化率较高,但生产强度(葡萄糖消耗速度)较低低溶氧下,葡萄糖消耗速度加快,然而丙酮酸产率却明显下降代谢网络分析PyrEt14.7PEP74.65.5OAAAcCoA7.9PyrEt14.7PEP74.65.5OAAAcCoA7.9DO=10%PyrEt2.4PEP94.66.1OAAAcCoA8.7PyrEt2.4PEP94.66.1OAAAcCoA8.7DO=85%PEP到Pyr的通量增加了20%,丙酮酸进一步代谢的通量下降了63.3%高溶氧下转化率高的原因如何提高丙酮酸发酵的转化率和生产强度?--分阶段溶氧控制辅因子分析NADHATP39.0NADHATP39.0NADHATP20.7NADHATP20.7总ATP下降31.4%,NADH下降18.6%生产强度(葡萄糖消耗速度)59%低溶氧生产强度高的原因DO=10%DO=85%LimingLiu,*JianChen.JournalofBiotechnology,2006,126(2):173-185Li-MingLiu,*JianChen.FEMSYeastResearch,2006,6:1117–112927高产量(89.4g/L)高产率(0.636g/g)高生产强度(1.95g/(Lh))确定分阶段供氧模式:发酵0-16h控制kLa为450h-1,16h后将kLa降低至200h-1碳平衡分析前16h较高溶氧有利于碳流合成细胞;采用单一高或低供氧模式,不能同时达到高转化率和高生产强度!16h后耗氧速率恒定,碳流转向合成丙酮酸结果0~16h16~32h32~48hafter48hkLa/h-1450300200450300200450300200450300200Glucose1100100100100100100100100100100100100Cellgrowth247302717131613131131011Pyruvate444132806055837057827841Ethanol222000000000Residualcarbon727393272951732141248如何提高丙酮酸发酵的转化率和生产强度?--分阶段溶氧控制分阶段溶氧控制!如何分阶段?LimingLiu,*JianChen.BiotechnologyandBioengineering,2007,97(4):825-832LimingLiu,*JianChen.JournalofBiotechnology,2006,126(2):173-18528PC(Bio)OAAGlucoseAcetateAcCoAPDHbypassPyruvateAcetaldehydeEthanolPDC(B1)PyruvatePDH(B1)AcCoACitrateOAA-KG10g/L59g/LAGlucosePyruvateAcetaldehydeEthanolPDC(B1)PC(Bio)OAAPyruvatePDH(B1)AcCoACitrateOAA-KGAcetateAcCoAPDHbypass14g/L53g/LB如何使酵母从积累丙酮酸转向积累-酮戊二酸--辅因子调控打开丙酮酸脱氢酶系(PDH)途径打开丙酮酸羧化酶(PC)途径29LLiu,YLi,ZShi,GDu,*JChen.MetabolicEngineering,2007,9(1):21-29GlucosePyruvateAcetaldehydeEthanolPDC(B1)PC(Bio)OAAPyruvatePDH(B1)AcCoACitrateOAA-KGAcetateAcCoAPDHbypass21g/L48g/LCGlucosePyruvateAcetaldehydeEthanolPDC(B1)PC(Bio)OAAPyruvatePDH(B1)AcCoACitrateOAA-KGAcetateAcCoAPDHbypass44g/L22g/LCaCO3D从积累丙酮酸转向积累-酮戊二