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微生物发酵工程5微生物发酵类型及培养基25微生物发酵类型及培养基微生物发酵的类型和方式培养基选择和配制的原则培养基的设计淀粉水解糖的制备基因工程菌的不稳定性及对策5微生物发酵类型及培养基35微生物发酵类型及培养基一．发酵类型：发酵类型是为了描述菌体生长，碳源利用与代谢产物形成速率变化，以及它们相互间动力学关系而确定的。5.1微生物发酵的类型和方式45微生物发酵类型及培养基1．动力学描述参数菌体生长速率比生长速率菌体得率系数产物得率系数（Vx）：单位体积，单位时间里生长的菌体量g/(Lh)（µ）：菌体浓度除菌体生长速率或繁殖速率h-1（Yx/s）:消耗1g或1mol营养物质生成的菌体的g数或mol数（Yp/s）：消耗1g或1mol营养物质生成的产物的g数或mol数55微生物发酵类型及培养基231产物形成直接与碳源利用有关产物形成间接与碳源利用有关产物形成表面上与碳源利用有关2．发酵类型根据产物的形成与基质消耗的关系分65微生物发酵类型及培养基2．发酵类型IIIIII特点菌体生长，碳源利用和产物形成几乎都在相同的时间出现高峰。微生物生长和产物合成是分开的。糖既满足细胞生长所需能量又充作产物合成的碳源。产物形成一般在菌体生长接近或达到最高生长时期。产物形成与碳源利用无准量关系。75微生物发酵类型及培养基85微生物发酵类型及培养基1．分批发酵：是一种准封闭式系统。一次投料，一次接种，一次收获的间歇式培养方式。培养过程中，接种物要经过5个时期。即延迟期、对数生长期、减速期、稳定期和衰亡期。二．发酵方式：分批培养的特点：操作简单、周期短、染菌机会少和生产过程、产品质量易掌握。但是生产率相对较低。95微生物发酵类型及培养基105微生物发酵类型及培养基细胞浓度随培养时间呈指数增长。细胞浓度的变化率与细胞浓度成正比。2对数生长期细胞的比生长速率开始下降3细胞浓度达到最大值，细胞的比生长速率为04活细胞浓度不断下降5细胞浓度的增加不明显。受菌龄和接种量的影响。1延迟期减速期静止期衰亡期特点115微生物发酵类型及培养基对数生长期：dX/dt=µX其中：X---细胞干重t---时间µ---比生长速率微生物的比生长速率µ与微生物的种类、培养温度、pH、培养基成分及限制性基质浓度等因素有关。125微生物发酵类型及培养基135微生物发酵类型及培养基分批培养过程的生产率P:生产率=产物浓度/发酵时间生产率是评价发酵过程的成本和效率的综合指标。在分批培养时，计算时间还应包括放罐、清洗、装料和消毒的时间等非发酵过程所占用的时间。145微生物发酵类型及培养基155微生物发酵类型及培养基2.连续发酵：连续发酵是指在培养过程中，连续地向发酵罐中加入培养基，同时以相同的流速从发酵罐中排出含有产品的培养基的发酵方式。一般连续培养方式很多：搅拌发酵罐和管式反应器；恒化和恒浊；循环式和非循环式；单级和多级。165微生物发酵类型及培养基依据培养物的生长率是受到化学环境控制的。即培养基中某一限制性组分的作用。恒化12控制补充的培养基的流速，使培养液的细胞浓度保持恒定。恒浊175微生物发酵类型及培养基连续发酵先作分批培养，让微生物生长繁殖达到一定程度，并进入产物合成期，然后开始以恒定的流量向发酵罐流加培养基，同时以相同的流量排放培养液，使发酵罐内培养液的体积保持恒定，微生物能持续生长并合成产物。进行单级连续培养时，流出的培养液进行固液分离后，经浓缩的细胞悬液再被送回发酵罐中的方法。把多个发酵罐串连起来，第一个罐的情况与单罐培养相同，以后下一罐的进料便是前一发酵罐的出料，这样就组成了多级串联连续培养。循环式单级连续培养多级串联连续培养非循环式：185微生物发酵类型及培养基单级连续培养进入稳定状态后，细胞的比生长速率与稀释率相等。连续培养的最大特点：微生物细胞的生长速率、产物的代谢均处于恒定状态，可达到稳定、高速培养微生物细胞或生产大量的代谢产物的目的。生产率得以提高。195微生物发酵类型及培养基3．补料分批发酵在分批培养过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基，而不从发酵罐中间断地放出培养液的培养方法。工业上利用分批补料培养以消除阻遏并保持通气条件。分批补料培养还可以防止培养基中某一组分的毒性。205微生物发酵类型及培养基215微生物发酵类型及培养基培养基：提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的，按一定比例配制的多种营养物质的混合物。5.2培养基选择和配制的原则225微生物发酵类型及培养基一、培养基的类型和用途基础，繁殖和鉴别培养基天然合成和半合成孢子，种子和发酵培养基根据来源根据目的根据生产工艺235微生物发酵类型及培养基二.培养基的选择231从微生物的特点来选择从生产和科研的要求选择从经济效益方面考虑245微生物发酵类型及培养基对培养基的要求提供合成细胞和发酵产物的基本成分利于减少培养基原料的单耗利于提高培养及产物的浓度利于减少能耗减少副产物，利于产品的分离纯化利于提高产物的合成速率三．培养基的配制原则255微生物发酵类型及培养基适当配比渗透压pH氧化还原电位营养需要原则265微生物发酵类型及培养基典型培养基275微生物发酵类型及培养基完善的培养基设计是实验室的实验，实验工厂的放大和生产规模中的一个重要步骤。培养基的组成必须满足细胞的生长和代谢所需的元素，并能提供生物合成和细胞维持活力所需要的能量。5.3培养基的设计285微生物发酵类型及培养基一.培养基的成分1234能源物质碳源物质氮源物质无机盐和微量元素295微生物发酵类型及培养基一.培养基的成分5678生长因子前体促进剂和抑制剂水分305微生物发酵类型及培养基光能：光能自养微生物的能源。极端嗜盐菌进行海水淡化，藻类发酵等氢、硫、氨、亚硝酸盐、亚铁盐等是化能自养微生物的能源。碳水化合物等有机物、石油、天然气及石油化工产品是异养微生物的能源。1能源物质315微生物发酵类型及培养基。碳源细胞碳骨架产物能源2.碳源物质主要包括：糖类，脂类，有机酸，低碳糖等325微生物发酵类型及培养基蔗糖麦芽糖乳糖糊精淀粉葡萄糖糖类碳源脂类有机酸类335微生物发酵类型及培养基有机氮和无机氮作用菌体细胞结构含氮代谢产物细胞提供能源3氮源物质345微生物发酵类型及培养基花生饼粉，黄豆饼粉，棉籽饼粉，酵母粉，麦麸，鱼粉，蚕蛹粉，玉米浆，蛋白胨，尿素，废菌体和酒糟氨水，铵盐和硝酸盐有机氮无机氮355微生物发酵类型及培养基4．无机盐和微量元素磷，镁，硫，铁，钾，钠，铅，氯，锌，钴，锰等。较低浓度对细胞的生长和产物合成有促进作用，而在高浓度时常表现出显著的抑制作用365微生物发酵类型及培养基作用酶的激活剂生理活性物质的调节剂生理活性物质的组成375微生物发酵类型及培养基辅酶的组成成分高能化合物缓冲剂细胞结构磷酸盐的作用385微生物发酵类型及培养基硫含硫氨基酸许多酶的辅酶的活性基产物硫酸钠硫代硫酸钠395微生物发酵类型及培养基己糖磷酸化酶，柠檬酸脱氢酶，羧化酶等的激活剂。2是链霉素发酵的必需元素3锌是维生素B12的激活剂，可以促进产物合成4钴维持细胞渗透压5钾和钠影响细胞膜的透性；钙还影响磷酸盐的浓度6细胞色素，细胞色素氧化酶，过氧化物酶等的组成成分，是微生物有氧氧化的必不可少的元素1铁镁钾和钙405微生物发酵类型及培养基微生物生长不可缺少的微量有机物，称为生长因子。如氨基酸，嘌呤，嘧啶，维生素等。作用：构成细胞的组成成分，促进生命活动的进行。5．生长因子415微生物发酵类型及培养基1）生物素作用：影响产生菌细胞膜的通透性，同时影响菌体的代谢途径。一般5μg/L。425微生物发酵类型及培养基生物素过量不足不产或少产谷氨酸产乳酸或琥珀酸长菌快，pH低，尿素消耗多菌体生长不好谷氨酸产量低弱发酵向乳酸发酵转换435微生物发酵类型及培养基2）维生素B1：对某些菌种发酵有促进作用。3）天然原料：玉米浆，0.4-0.8%麸皮水解液，1%糖蜜，0.1-0.4%酵母445微生物发酵类型及培养基某些化合物被加到培养基后，能够直接在生物合成过程中结合到产物分子中去，而自身的结构并未发生太大的变化，却能提高产品的产量。这类小分子物质称为前体。6．前体455微生物发酵类型及培养基465微生物发酵类型及培养基7．促进剂和抑制剂促进剂是一类刺激因子，他们并不是前体或营养，其加入可以影响微生物的正常代谢，或促进中间代谢产物的积累，或提高次级代谢产物的产量。常用的促进剂诱导物，表面活性剂，乙二胺四乙酸，大豆油抽提物等。475微生物发酵类型及培养基在发酵过程中，加入抑制剂会抑制某些代谢途径的进行，同时刺激另一代谢途径，以至于可以改变微生物的代谢途径。485微生物发酵类型及培养基495微生物发酵类型及培养基8．水分参与细胞内一系列化学反应2有效控制细胞内的温度变化3维持大分子的天然构象4脱水作用和水合作用控制有多亚基组成的结构5溶剂和运输介质的作用1微生物发酵工程5微生物发酵类型及培养基515微生物发酵类型及培养基微生物发酵的类型和方式培养基选择和配制的原则培养基的设计淀粉水解糖的制备基因工程菌的不稳定性及对策5微生物发酵类型及培养基525微生物发酵类型及培养基一.培养基的成分1234能源物质碳源物质氮源物质无机盐和微量元素535微生物发酵类型及培养基一.培养基的成分5678生长因子前体促进剂和抑制剂水分545微生物发酵类型及培养基严格控制营养物质的浓度和比例，不仅仅是为了维持正常的渗透压，节约原料，而且直接影响到菌体的繁殖和产物积累。二．营养物质的调节555微生物发酵类型及培养基1不同碳源的利用速度2氮源利用和碳源利用的关系3碳氮比例的调节4前体的控制5补料565微生物发酵类型及培养基1).不同碳源的利用速度能够被微生物快速利用的碳源称为速效碳源，反之为迟效碳源。利用速度依次为：葡萄糖---乳酸----乳糖575微生物发酵类型及培养基微生物对氮源的利用速度为：氨态氮----硝态氮----有机氮。氨的过高过低都会对产物形成造成不良的影响。氮源的利用速度与碳源的利用速度是很有关系的。糖代谢的许多中间产物是氨基酸合成的前体。2).氮源利用和碳源利用的关系585微生物发酵类型及培养基生产上多采用控制碳氮比例以满足菌体的大量繁殖，又能大量形成产物。酵母细胞的碳氮比为：100：20；霉菌细胞的碳氮比为：100：10。发酵培养基的碳氮比约为：100：0.2-2.0。谷氨酸生产中的碳氮比约为：100：15-21。3).碳氮比例的调节595微生物发酵类型及培养基4).前体的控制加入量加入方式菌种前体605微生物发酵类型及培养基补料丰富培养基产物合成的旺盛期延长控制pH和代谢方向改善了通气效果解除终产物反馈5)补料615微生物发酵类型及培养基补料的物质碳，氮和水及其他物质。碳源有葡萄糖，饴糖，蔗糖，糊精，淀粉，油脂等。补料氮源有氨水，硫酸铵，硝酸钠，蛋白胨，花生饼粉，黄豆饼粉，玉米浆和尿素等。补料的方法关键是控制补料时间，速率和配比。其目的是不使菌体生长过快，仅仅维持呼吸，但是仍能合成产物。625微生物发酵类型及培养基碳源和能源+氮源+其他需要细胞+产物+CO2+H2O＋热量组成微生物的元素包括Ｃ、Ｈ、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、Ｍｇ和Ｋ，这些元素都要在方程中予以平衡。培养基中还需要微量元素(Ｆｅ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｂ等)。三．培养基的设计635微生物发酵类型及培养基645微生物发酵类型及培养基对于无力合成的生长因子，要通过在培养基中加入适量的纯净物或含有该物质的混合物。碳源具有生物合成的底物和能源的双重作用。在需氧的条件下对碳源的需要量可以通过菌体得率系数推算而得655微生物发酵类型及培养基二糖低聚糖葡萄糖淀粉水解糖工业上，将淀粉水解成葡萄糖的过程称为淀粉的糖化。5.4淀粉水解糖的制备665微生物发酵类型及培养基发酵用淀