第七章 紫外-可见分光光度法

案例导入在夏天参加户外活动时，如果天气晴朗，就应该注意保护皮肤，否则，暴露在火辣辣太阳之下的皮肤，数小时后就会出现红肿、瘙痒、发热、刺痛症状，数日后出现蜕皮现象，这表明太阳光中有一种光线能伤害生物细胞。科学家研究证实，这种光线是紫外线。根据可见光、紫外光与物质分子的相互作用建立了紫外-可见分光光度法，第一节概述一、物质对光的选择性吸收单色光:单一波长的光束复合光:含有多种波长的光束电磁波谱:以波长大小顺序排列的电磁波谱图波长10pm300pm200nm400nm800nm500mm1cm1m光谱射线X射线紫外光可见光红外光微波无线电波方法光谱法分光光度法光谱法核磁共振可见光第一节概述红光与绿光互补、紫光与黄光互补，等等。白光的组成白光的色散第一节概述二、透光率与吸光度I0＝Ia+ItlgAT第一节概述透射光强度It与入射光强度I0的比值称为透光率或透光度T透光率的负对数为吸光度A第一节概述三、吸收光谱曲线概念：以波长λ为横坐标，吸光度A为纵坐标所描绘的曲线，称为吸收光谱曲线，简称吸收光谱。特点：在相同条件下，同一物质的不同浓度的溶液，其吸收光谱曲线相似，且λmax相同。这是定性分析的基础。第一节概述吸收光谱曲线示意图A480520560nmmax=515第一节概述四、紫外-可见分光光度的特点特点灵敏度高准确度高精密度好选择性好易于普及应用广泛仪器简单操作简便价格低廉测定快速课堂活动1．紫外-可见光的波长范围是A．200~400nmB．400~760nmC．200~760nmD．360~800nm2．下列叙述错误的是A．光的能量与其波长成反比B．有色溶液越浓，对光的吸收也越强烈C．物质对光的吸收有选择性D．光的能量与其频率成反比第一节概述课堂活动3．紫外-可见分光光度法属于A．原子发射光谱法B．原子吸收光谱法C．分子发射光谱法D．分子吸收光谱法4．分子吸收可见-紫外光后，可发生哪种类型的分子能级跃迁A．转动能级跃迁B．振动能级跃迁C．电子能级跃迁D．以上都能发生第一节概述第一节概述点滴积累1．光的本质是电磁波；物质对光的吸收具有选择性。2．吸光度与透光率的关系是:3．吸收曲线是溶液在一定条件下的吸光度随入射光波长变化而变化的曲线。第二节紫外-可见分光光度法的基本原理一、光的吸收定律当一束平行的单色光通过均匀、无散射的含有吸光性物质的溶液时，在入射光的波长、强度及溶液的温度等条件不变的情况下，该溶液的吸光度A与溶液的浓度c及液层厚度L的乘积成正比，即：A＝K·L·c。称为光的吸收定律（朗伯-比尔定律）。光的吸收定律是定量分析的理论依据。第二节紫外-可见分光光度法的基本原理朗伯-比尔定律不仅适用于可见光，而且也适用于紫外光和红外光；不仅适用于均匀、无散射的溶液，而且也适用于均匀、无散射的固体和气体。实验证明：溶液对光的吸光度具有加和性。如果溶液中同时存在两种或两种以上的吸光性物质，则测得的该溶液的吸光度等于溶液中各吸光性物质吸光度的总和，即：A（a+b+c）＝Aa＋Ab＋Ac第二节紫外-可见分光光度法的基本原理第二节紫外-可见分光光度法的基本原理二、吸光系数摩尔吸光系数：在入射光波长一定时，溶液浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时所测得的吸光度称为摩尔吸光系数，常用ε表示。光吸收系数在入射光波长一定时，溶液浓度为1g/L，液层厚度为1cm时的吸光度，称为光吸收系数，常用表示，其量纲为L/(g·cm)。第二节紫外-可见分光光度法的基本原理百分吸光系数：在入射光波长一定时，溶液浓度为1﹪（W/V）、层厚度为1cm时所测得的吸光度称为百分吸光系数，常用表示。二者的关系：1%110cmME1%1cmE10E,M%1cm1课堂活动用双硫腙测定Cd2+溶液的吸光度A时，Cd2+（Cd的原子量为112）的浓度为140μg/L，在λ＝525nm波长处，用L＝1cm的吸收池，测得吸光度A＝0.220，试计算摩尔吸光系数和百分吸收系数。第二节紫外-可见分光光度法的基本原理课堂互动某有色溶液的物质的量浓度浓度为c，在一定条件下用1cm比色杯测得吸光度为A，则摩尔吸光系数应为：A．cAB．cMC．A/CD．C/A第二节紫外-可见分光光度法的基本原理第二节紫外-可见分光光度法的基本原理三、偏离光的吸收定律的主要因素化学因素:(1)溶液的浓度(2)物质的化学变化(3)溶剂的影响光学因素:(1)非单色光(2)杂散光(3)非平行光(4)反射现象(5)散射现象第二节紫外-可见分光光度法的基本原理偏离光的吸收定律示意图第二节紫外-可见分光光度法的基本原理点滴积累1．光的吸收定律表明了吸光度与液层厚度和浓度之间的关系，它是吸收光谱法定量分析的依据。2．吸光系数的表示方法有多种，随待测溶液浓度的不同标度而不同。3．偏离光的吸收定律的因素主要有化学因素和光学因素。一、紫外-可见分光光度计的主要部件：光源—单色器—吸收池—检测器—讯号处理与显示器第三节紫外-可见分光光度计第三节紫外-可见分光光度计二、紫外-可见分光光度计的光学性能1．测光方式2．波长范围3．狭缝或光谱带宽4．杂散光5．波长准确度6．吸光度范围7．波长重复性8．测光准确度9．光度重复性10．分辨率第三节紫外-可见分光光度计三、紫外-可见分光光度计的类型1.可见分光光度计721型第三节紫外-可见分光光度计三、紫外-可见分光光度计的类型1.可见分光光度计722型第三节紫外-可见分光光度计三、紫外-可见分光光度计的类型2.紫外-可见分光光度计（1）单波长分光光度计单光束分光光度计双光束分光光度计第三节紫外-可见分光光度计课堂活动1.试述紫外-可见分光光度计的主要部件及其作用？2.紫外-可见分光光度计有哪些类型？第三节紫外-可见分光光度计第三节紫外-可见分光光度计点滴积累紫外-可见分光光度计的基本结构相同，都由光源、单色器、吸收池、检测器、讯号处理与显示器等主要部件构成，但不同型号仪器的外形差别很大，质量和价格相差悬殊，操作方法迥异，使用之前应仔细阅读仪器使用说明书。一、仪器测量条件的选择1.应选择最大吸收波长作为入射光。2.应控制吸光度读数范围：吸光度在0.2~0.7之间；透光率在20%~65%之间。第四节分析条件的选择第四节分析条件的选择二、显色反应条件的选择1.对显色剂及显色反应的要求2.控制合适的显色反应条件三、参比溶液的选择1.溶剂参比溶液2.试样参比溶液3.试剂参比溶液4.平行操作参比溶液第四节分析条件的选择课堂活动测定试样时，吸光度的读数应控制在0.2～0.7范围内。若吸光度读数不在此范围，可采用哪些方法进行调整?第四节分析条件的选择点滴积累1．选择吸光性物质的最大吸收波长作为测定波长。2．使用紫外-可见分光光度计时，读数范围应控制在吸光度为0.2～0.7，透光率为65%～20%之间。3．待测物质在紫外-可见光区无吸收时，应加显色剂。显色剂不得有干扰，反应必须完全。4．一般用溶剂作参比溶液。必要时采用试样参比溶液、试剂参比溶液或平行操作参比溶液。一、定性分析方法定性的基本依据：比较光谱的一致性。未知物和标准品的吸收光谱曲线，对比二者是否一致。比较吸收光谱的特征数据及比值的一致性。二、杂质检查：将药品光谱与药品标准光谱相对照，利用杂质的特征吸收，可以检测出微量杂质及其含量。第五节定性定量方法案例分析贝诺酯的定性鉴别中国药典(2010年版)规定：贝诺酯加无水乙醇制成每1ml约含7.5μg的溶液，在240nm处有最大吸收，相应的百分吸光系数()应为730～760。维生素B12也有三个吸收峰，分别在278nm、361nm、550nm波长处，它们的吸光度比值应为：A361nm/A278nm在1.70～1.88之间，A361nm/A550nm在3.15～3.45之间。第五节定性定量方法%11cmE案例分析葡萄糖注射液是临床上常用的药品之一。制备时需要高温灭菌，葡萄糖会转化为5-羟甲基糠醛而引入杂质。《中国药典》（2010年版）规定葡萄糖注射液在284nm波长处的吸收度不得过0.32，以此控制其杂质5-羟甲基糠醛的量。在284nm波长处，葡萄糖无吸收，而杂质5-羟甲基糠醛在此波长处有最大吸收，可以通过控制供试品溶液在此波长处的吸收度来控制杂质的含量。第五节定性定量方法第五节定性定量方法三、定量分析方法定量分析的依据:A＝K·c·L（光的吸收定律）（一）单组分溶液的定量方法1.标准曲线法：是紫外-可见分光光度法中最经典的定量方法。第五节定性定量方法标准曲线法的方法和步骤如下:（1）配制一系列不同浓度的标准溶液，选择合适的参比溶液，在相同条件下，以待测组分的最大吸收波长作为入射光，分别测定各标准溶液对应的吸光度。（2）以浓度c为横坐标、吸光度A为纵坐标描绘标准曲线。max第五节定性定量方法（3）按照相同的实验条件和操作程序，用待测溶液配制未知试样溶液并测定其吸光度A样，在标准曲线上找到与之对应的未知试样溶液的浓度c样。如右图。第五节定性定量方法2.标准对比法:在相同的条件下，配制浓度为cs的标准溶液和浓度为cx的试样溶液，在最大吸收波长处，分别测定二者的吸光度值为As、Ax，依据朗伯-比尔定律得：As=csLAx=cxL则:SSXxAcAc第五节定性定量方法3.吸光系数法:吸光系数法直接利用朗伯-比尔定律的数学表达式A＝KcL进行计算的定量分析方法。在手册中查出待测物质在最大吸收波长处的吸光系数或,并在相同条件下测量样品溶液的吸光度A，则其浓度为：或%1cm1EAcLmaxLEA%1cm1第五节定性定量方法有时也可以将待测样品溶液的吸光度换算成样品组分的吸光系数，计算与标准品的吸光系数的比值，求出样品中待测组分的质量分数。或样标%1cm1%1cm1标样EE第五节定性定量方法实例：维生素B12水溶液在=361nm处的百分吸光系数=207。取维生素B12样品30.0mg，加纯化水溶解，用1L的容量瓶定容。将溶液盛于1cm的吸收池，测得361nm波长处的吸光度A=0.600，试求样品中维生素B12的质量分数。解：max%1cm1E330.010100%0.00300100020000.100300.0600.0%1cm1LAE样966.0207200%1cm1%1cm1标样EE第五节定性定量方法（二）二元组分溶液的定量方法1.解联立方程组法当试样溶液中各待测组分相互干扰不太严重时，可根据吸光度具有加和性的特点，在同一试样溶液中同时测定两个或两个以上的待测组分。假设要测定试样中有两个待测组分a和b，如果分别绘制a、b两个纯物质的吸收光谱，则有三种情况。第五节定性定量方法第五节定性定量方法（Ⅰ）表明，两个待测组分在各自的最大吸收波长处，另一组分没有吸收，可以用测定单组分溶液的方法，分别在λ1和λ2波长处测定组分a、b的吸收度,由光的吸收定律求得ca、cb。测定时两组分互不干扰。（Ⅱ）表明，在组分a的最大吸收波长λ1处，组分b对组分a的测定无干扰，而在组分b的最大吸收波长λ2处，组分a对组分b的测定有干扰。这时，先在λ1波长处单独测量组分a；然后在λ2波长处测量组分a、b的总吸光度，根据吸光度的加和性，从而可以求出cb。第五节定性定量方法（Ⅲ）表明，两个待测组分彼此相互干扰，此时，在波长λ1和λ2处分别测定试样溶液的总吸光度及，同时测定a、b纯物质的吸光系数、和、，根据吸光度的加和性，则由联立方程组求得ca、cb。1abA2abA1a1b2a2b第五节定性定量方法2.等吸收波长消去法（双波长分光光度法）当试样中两个待测组分的相互干扰比较严重时，用解联立方程组的方法进行定量分析会产生较大的误差，这时可以用等吸收波长消去法进行测定。在试样中含有两个待测组分a和b时，若要测定组分b，组分a有干扰，应设法消除组分a的吸收干扰。首先选择待测组分b的最大吸收波长λ2作为测量波长，然后用作图的方法选择参比波长λ1，使组分a在这两个波长处的吸光度相等。第五节定性定量方法试样溶液在λ2和λ1两个